[發明專利]一種香石竹的超低溫保存方法以及再培養方法

無效

• 申請號: 201110235122.5
• 申請日: 2011-08-16
• 公開（公告）號: CN102379281A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 林田;劉灶長;楊華;李天菲;陳海榮;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及植物超低溫的保存方法，具體涉及一種香石竹的超低溫保存方法以及再培養方法。

背景技術

香石竹(Diarahus?caryophfllus?L.)為石竹科石竹屬常綠亞灌木宿根花卉，是世界著名的四大切花之一，其栽培種及野生種的資源有效保存對香石竹的國產化至關重要。通常通過品種圃扦插及組織培養定期繼代保存香石竹資源，但香石竹若侵染病毒，長期的無性繁殖易導致病毒體內不斷積累，難以有效長期保存種質，需尋找最適的保存方法。

種質資源的保存廣義上有現地保存和異地保存兩種。香石竹作為一種營養繁殖的宿根花卉，一般通過繁種圃或保存圃的田間種植方式來保存。這種保存方式需要通過年復一年的扦插來維持，不僅占用耕地，而且栽培管理中又耗時費力，還存在受干旱、洪澇、低溫、熱害、病蟲害等自然災害的影響而導致種質毀滅的危險性，不適應于長期保存(Withers?L.A.and?Engels?J.M.M.1990.The?test?tube?genebank-a?safe?alternative?to?field?conservation，IBPGR?Newsletter?for?Asia?and?the?Pacific?3，1-2.)。在此背景下，超低溫保存被認為是這類植物目前安全、有效、成本效益比合算的基因資源長期保存的最有希望的保存方法。超低溫條件下，植物的生理生化活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內(Engelmann?F.1997.In?vitro?conservation?methods.In：Callow?JA，Ford-Lloyd?BV，Newbury?HJ(eds)Biotechnology?and?plant?genetic?resources.CAB?International，Oxford，pp?119-161.)。

現已證明，植物離體材料經超低溫保存后，仍能在適宜的條件下迅速大量繁殖，再生出新的植株，并保持原來的遺傳特性。它避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質變異或毀滅，以及組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。關于植物超低溫保存的研究，在進入到上世紀的90年代后，保存技術的多樣化與簡易化方面不斷取得進步，能夠保存的植物物種數也在不斷地增長，但多數集中在蘋果、櫻桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及馬鈴薯、紅薯、草莓等薯類植物為主的植物遺傳資源的超低溫保存(Sakai?A?and?Nishiyama?Y.1978.Cryopreservation?of?winter?vegetative?buds?of?hardy?fruit?trees?in?liquid?nitrogen.Hortic?Sci?13：225-227.)。

超低溫保存有多種方法，近來經常運用的以PVS2作為冷凍保存液的玻璃化法，即植物材料經高濃度的保護液中處理后，迅速投入液氮中，水分形成玻璃化狀態從而避免形成冰晶造成機械損傷，有效保護植物的保存方法，被運用于100多種植物不同組織的超低溫保存(Akira?Sakai?and?Florent?Engelmann，2007)。近年來在常規玻璃化法上發展出來的小液滴法，將植物材料經玻璃化處理后，在鋁箔上滴成小液滴，然后直接投入液氮進行迅速冷凍。由于凍存及解凍速度快，組織不易形成冰晶，易成活再生，是一有發展前景的方法。

國外關于香石竹的超低溫研究始于20世紀70年代，其成活率僅為2％(Seibert，1976)。Sakai將4-8℃馴化處理的香石竹莖尖通過慢凍法(Uemura?and?Sakai，1980)進行超低溫保存，成活率提高到70-80％。后通過兩步冷凍法及程序降溫法可使香石竹的成活率達90％。(Dereuddre?et?al.，1987；Fukai，1989)。隨著玻璃化試劑發明，Langis于1990采用玻璃化法成功保存了香石竹莖尖。此后，在常規玻璃化方法基礎上的小液滴玻璃化法，保存香石竹莖尖的做法目前沒有看到報道。Halmagyi將香石竹3個品種的莖尖用海藻酸鈉包埋玻璃化處理后進行凍存，成活率可達60％～73％。

發明內容

本發明的目的是在現有超低溫保存研究的基礎上，提供一種香石竹的超低溫保存方法。

上述保存方法包括以下步驟：

(1)切取香石竹組培苗的莖尖進行預培養；

(2)預培養后的莖尖用含有1～3mol·L^-1甘油和0.2～0.6mol·L^-1蔗糖的MS液體培養基預處理20～40min；