[發明專利]一種AFP-IgM檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201110231053.0
• 申請日: 2011-08-12
• 公開（公告）號: CN102435733A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 徐斌;蔣敬庭;吳昌平;陸明洋
• 申請（專利權）人: 徐斌;蔣敬庭;吳昌平;陸明洋
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 北京市惠誠律師事務所 11353
• 代理人: 王美華

1.一種檢測患者體內AFP-IgM含量的試劑盒，包括下列試劑：作為標準品的人免疫球蛋白IgM、作為標準品包被抗體的抗IgM抗體、作為檢測樣品包被抗體的抗AFP抗體、作為酶標記檢測抗體的抗IgM辣根過氧化物酶標記物、作為顯色劑的四甲基聯苯胺溶液、作為終止液的2M?H₂SO₄溶液、包被緩沖液、洗滌緩沖液、稀釋緩沖液。

2.權利要求1所述的試劑盒，特征在于標準品包被抗體IgM抗體為羊抗人IgM多克隆抗體，0.2μg/ml，0.3ml。

3.權利要求1所述的試劑盒，特征在于檢測樣品包被抗體抗AFP抗體為鼠抗人AFP單克隆抗體，0.2μg/ml，0.3ml。

4.權利要求1所述的試劑盒，特征在于抗IgM辣根過氧化物酶標記物為兔抗人辣根過氧化物酶標記物，0.5mg/L，0.1ml。

5.權利要求1所述的試劑盒，特征在于包被緩沖液為PH9.6?0.05M碳酸鹽緩沖液。

6.權利要求1所述的試劑盒，特征在于洗滌緩沖液為PH7.4?0.15M磷酸鹽緩沖溶液。

7.權利要求1所述的試劑盒，特征在于稀釋緩沖液為牛血清白蛋白與洗滌緩沖液配成質量分數0.1％使用或以羊血清、兔血清與洗滌緩沖溶液配成質量分數5～10％使用。

8.權利要求1所述的試劑盒，特征在于四甲基聯苯胺溶液由2mg/ml四甲基聯苯胺無水乙醇溶液0.5ml、PH5.0底物緩沖液10ml、0.75％H₂O₂?32μl制得，其中PH5.0底物緩沖液由0.2M?Na₂HPO₄?25.7ml、0.1M檸檬酸24.3ml，加蒸餾水50ml制得。

9.權利要求1-8任一項試劑盒檢測患者體內體內AFP-IgM含量的方法，包括下列步驟：

第一步：包被

(1)標準品孔用IgM抗體包被于酶標板孔內；

(2)檢測孔用AFP抗體包被于酶標板孔內；

第二步：洗滌酶標板孔，移去包被液；

第三步：通過倍比稀釋建立標準品濃度梯度，標準品孔分別加入各個濃度的人免疫球蛋白IgM標準品；樣品孔加入稀釋的血清或血漿被檢標本；并建立陰性、陽性對照，陰性對照為稀釋緩沖液，陽性對照為陽性血清；37℃作用2小時，IgM標準品與包被的IgM抗體結合，被檢標本中AFP及AFP-IgM與包被的AFP抗體結合；

第四步：洗滌酶標板孔，將未結合的多余樣品去除；

第五步：每個凹孔加入兔抗人IgM辣根過氧化物酶標記物溶液，與復合物的IgM端結合；

第六步：洗滌酶標板孔，去除多余的抗IgM-HRP；

第七步：加入底物四甲基聯苯胺溶液于每個凹孔，顯色。

第八步：每個凹孔加終止劑H₂SO₄；

第九步：觀察記錄結果，在450nm波長下用酶標儀測定OD值。

第十步：計算檢測樣品中AFP-IgM濃度，通過倍比稀釋建立標準品濃度擬合曲線：y＝ax+b，x為標準品OD值，y為標準品濃度，獲得a、b值；測得待測樣品OD值為x1，則可計算待測樣品濃度y₁＝ax₁+b。

10.權利要求9所述的AFP-IgM含量的檢測方法，其特征是包括下列步驟：

第一步：包被

(1)標準品孔包被：用包被緩沖液稀釋羊抗人IgM多克隆抗體至0.2μg/ml，96孔酶標板的凹孔加0.3ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時，貯存冰箱；

(2)檢測孔包被：用包被緩沖液稀釋鼠抗人AFP單克隆抗體至0.2μg/ml，96孔酶標板的凹孔加0.3ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時，貯存冰箱；

第二步：每凹孔用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘，移去包被液；

第三步：通過倍比稀釋建立標準品濃度梯度，為0μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、16μg/L、32μg/L，標準品孔包括6孔，分別加入0.1ml各濃度的人免疫球蛋白IgM標準品，于第五、第六孔各加濃度為32μg/L的標準品0.1ml；樣品孔加入0.1ml?5倍稀釋血清或血漿被檢標本；并建立陰性、陽性對照，陰性對照為稀釋緩沖液，陽性對照為陽性血清；37℃作用2小時；

第四步：每凹孔用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘，將未結合的多余樣品去除；

第五步：加入酶標抗體，每凹孔加入0.1ml用稀釋緩沖液稀釋的兔抗人IgM辣根過氧化物酶標記物溶液，濃度為0.5mg/L，37℃作用1小時；

第六步：每凹孔用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘，去除多余的抗IgM-HRP；

第七步：加入0.1ml底物四甲基聯苯胺溶液于每個凹孔，室溫作用30分鐘；

第八步：加終止劑，每凹孔加2M?H₂SO₄?0.05ml；

第九步：觀察記錄結果，在450nm波長下用酶標儀測定OD值；

第十步：計算檢測樣品中AFP-IgM濃度，通過倍比稀釋建立標準品濃度擬合曲線：y＝ax+b，x為標準品OD值，y為標準品濃度，獲得a、b值；測得待測樣品OD值為x1，則可計算待測樣品濃度y₁＝ax₁+b。