[發明專利]一種拉曼編碼微球的用途及利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標志物的方法

有效

• 申請號: 201110226795.4
• 申請日: 2011-08-09
• 公開（公告）號: CN102323412A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 張忠平;劉仁勇;蔣長龍;劉變化;關貴儉
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/76;G01N21/65
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 何梅生

一、技術領域

本發明涉及一種拉曼編碼微球的用途及利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標志物的方法。

二、背景技術

惡性腫瘤是當前危害人類健康的重要疾病之一，全世界每年有1000多萬新病例和600多萬人死亡。近年來，在醫學家、生物學家的努力下，人類對于自身的認識已進入微觀層次的剖析，從而對于腫瘤發生、發展的機制也有了更多的認識。在DNA、RNA、蛋白質、染色體以及細胞水平上觀察到一系列和細胞癌變相關的變化，這些異常的變化，實質上就是細胞癌變不同階段的標志。以腫瘤相關抗原作為腫瘤標志物，通過免疫分析技術進行檢測，有望實現對腫瘤的早期診斷。

目前，腫瘤標志物的檢測主要是通過酶免疫測定、放射免疫分析、熒光免疫分析、化學發光免疫分析以及電化學發光免疫分析來實現。這些方法大部分都具有很高的精度和靈敏度，可以根據所測對象的性質選擇某一種方法進行測量。但是它們都不同程度存在著操作復雜、費時費力、成本高等缺點。例如，酶免疫檢測技術需要特制的進口試劑盒，并且生物酶的獲取困難、成本較高，實驗條件也較為苛刻等；熒光檢測會受到樣品自身熒光的干擾以及光漂白效應等。此外，不同類型的腫瘤往往存在相同的腫瘤標志物，而同種類型的腫瘤也存在多種腫瘤標志物，單一指標檢測特異性不強、靈敏度低。

三、發明內容

本發明旨在提供一種拉曼編碼微球的用途及利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標志物的方法，本方法具有靈敏度高、選擇性高且快速的特點。

本發明解決技術問題采用如下技術方案：

本發明拉曼編碼微球的用途的特點在于：所述拉曼編碼微球在腫瘤標志物檢測中的應用。

本發明拉曼編碼微球的用途的特點也在于：所述腫瘤標志物為癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、鐵蛋白、細胞角蛋白、鱗狀細胞癌抗原(SCC)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原199(CA199)、糖類抗原50(CA50)、糖類抗原153(CA153)、糖類抗原724(CA724)、糖類抗原242(CA242)或人絨毛膜促性腺激素(HCG)。

本發明利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標志物的方法的特點在于按以下步驟操作：

a、將25mg拉曼編碼微球分散到10mL?pH值為7.4的0.01M的磷酸緩沖液(PBS)中，加入125μg檢測抗體，在4℃下反應12小時得到納米探針，向所述納米探針中加入質量濃度為1％的牛血清白蛋白(BSA)封閉納米探針表面空位，離心、洗滌后得到拉曼編碼標記的納米探針，分散到PBS中保存備用；

b、將15mg二氧化硅包覆的磁性納米粒子分散到50mL?2mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中，室溫下攪拌30分鐘得到聚乙烯亞胺修飾的納米粒子，將所述聚乙烯亞胺修飾的納米粒子分散到質量濃度為2.5％的戊二醛溶液中反應1小時，離心、用PBS洗滌，然后加入75μg檢測抗體對應的包被抗體，在4℃環境下反應12小時，最后加入質量濃度為1％的牛血清白蛋白(BSA)封閉未反應的醛基空位，離心、洗滌后得到固相抗體，分散到PBS中保存備用；

所述聚乙烯亞胺溶液中添加有NaCl，NaCl的濃度為0.5M；

c、將50μL含有腫瘤標志物的血清加入到步驟b得到的固相抗體中，在37℃條件下反應1小時，磁性分離、洗滌后加入步驟a得到的拉曼編碼標記的納米探針，在37℃下反應1小時，磁性分離、洗滌后得到免疫復合物，分散到PBS中備用；

d、將步驟c得到的免疫復合物吸入毛細管中，利用外加磁場富集后進行SERS光譜的檢測。

本發明利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標志物的方法的特點也在于：所述的磁性納米粒子為Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃等具有超順磁性的納米粒子。

本發明使用的拉曼編碼微球是按照以下方法制備得到的：

a、將0.2g內核納米粒子加入到50mL?2mg/mL的聚電解質溶液中，室溫下攪拌30分鐘，離心、洗滌后得到聚電解質修飾的納米粒子，將所述聚電解質修飾的納米粒子分散到50mL金屬納米粒子溶膠中，室溫下攪拌30分鐘得到單層金屬納米粒子包覆的核殼納米粒子，將所述單層金屬納米粒子包覆的核殼納米粒子重復依次加入聚電解質溶液和金屬納米粒子溶膠中，得到多層金屬納米粒子包覆的核殼納米微球；

所述聚電解質溶液中添加NaCl，NaCl的濃度為0.5M。