[發明專利]惡臭假單胞菌及其催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸

有效

• 申請號: 201110224760.7
• 申請日: 2009-07-16
• 公開（公告）號: CN102268398A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 鄭裕國;柳志強;張濤;徐建妙;薛亞平;鄭仁朝;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/04;C12R1/40
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種產腈水解酶的微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，以及篩選獲得的具有腈水解酶活性的菌株。

(二)背景技術

亞氨基二乙酸(IDA)是一種比較重要的化工原料，具有很強的絡合能力能和多種金屬離子絡合而形成螯合物，和銅離子可以形成藍色的鰲合物，常用作絡合劑和表面活性劑，常用于有機合成，也是草甘膦(Glyphosate)生產的重要中間體。由于其分子中含有亞氨基和羧基，化學性質很活潑，廣泛應用于電鍍、染料、醫藥、電子等領域。是一種重要的化工中間體。

目前制備亞氨基二乙酸一般采用化學方法，根據原料的不同主要有氯乙酸法、氮川三乙酸法、氨代氯乙酸法、氫氰酸法、一乙醇胺法、二乙醇胺法等。傳統的化學方法存在產生成本高、污染嚴重、對設備要求高，或者使用劇毒的氫氰酸等弱點。利用生物催化亞氨基二乙腈生產亞氨基二乙酸與化學水解法相比，其優勢在于：(1)反應條件溫和。化學水解法需要在100℃左右進行，必須配備加熱和溫控裝置，反應條件苛刻，能耗高而且對設備要求高。而生物催化法一般都是在常溫下進行，反應條件溫和，設備成本相對較低。(2)原料消耗大幅度減少，基本不產生可溶性鹽。利用腈水解酶一步水解生成亞氨基二乙酸，省去了堿解和酸化工藝，避免了NaOH和濃鹽酸的大量使用。生物法中利用NH₄OH調節轉化體系的pH值，在產物回收中采用再生技術，可以有效減少可溶性鹽的排放。(3)廢水排放少。按照目前的化學水解工藝，生產每噸亞氨基二乙酸將至少產生廢水8噸。采用生物法后，以腈水解酶酶活力10萬單位計算(回用5次)，生產每噸亞氨基二乙酸的廢水量可控制在2噸以下，且廢水中不存在鹽類等難處理雜質，可生化性強。

利用腈轉化酶生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸，可以克服化學法生產亞氨基二乙酸的缺陷。生物催化是迄今為止人類所知道的最高效、最具選擇性的催化體系，可以提供許多傳統化學方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法，顯示出優良的化學選擇性、區域選擇性和立體選擇性。而且，生物轉化反應條件溫和、反應產物純度高、容易分離和純化，在農藥中間體的生產中，顯示出巨大的發展潛力。

(三)發明內容

本發明目的是微生物產酶培養得到腈水解酶催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸的制備方法。本發明所另一目的是提供篩選得到的產腈水解酶的微生物。

本發明采用的技術方案是：

惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putia)ZJB09135，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學，430072，保藏編號CCTCC?No：M?209055，保藏日期2009年3月18日。

上述菌株由浙江工業大學生物工程研究所從土壤中分離獲得。

本發明還涉及利用前述菌株微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，所述的方法是利用產腈水解酶的菌株，經產酶培養得到腈水解酶，以該酶為生物催化劑催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸。生物催化亞氨基二乙腈生產亞氨基二乙酸的過程如下：

本發明所述的制備亞氨基二乙酸的方法具體如下：

(A)將所述惡臭假單胞菌CCTCC?No：M?209055接種至產酶培養基，加入誘導劑a于100～200r/min、20～35℃條件下進行發酵培養2～5d；所述誘導劑a為正丁腈、異丁腈或己內酰胺；所述產酶培養基終濃度組成為：甘油8g/L，酵母膏6g/L，NaCl?1g/L，K₂HPO₄5g/L，MgSO₄0.2g/L，溶劑為水，pH值7.0；所述誘導劑a的終濃度為5g/L；

(B)取亞氨基二乙腈配制成質量濃度0.5％～6％的水溶液，調初始pH為7.0～7.5，作為酶催化反應底物溶液；以步驟(A)發酵獲得的濕菌體、細胞破碎獲得的粗酶液或經固定化得到的固定化細胞作為酶源，酶源加入量以濕菌體計為0.1～10g濕菌體/10mL底物溶液；控制反應溫度為30℃、反應pH為6.0～9.0，進行轉化反應8～16h，反應結束后，反應液經分離純化得到亞氨基二乙酸。

上述步驟(A)所述的發酵培養優選在30℃條件下進行發酵培養3d；步驟(B)所述的控制反應溫度優選為30℃，進行轉化反應10h。

本發明所述的產腈水解酶的微生物由如下方法篩選獲得，所述方法包括初篩和復篩：