[發明專利]一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法

有效

• 申請號: 201110223542.1
• 申請日: 2011-08-05
• 公開（公告）號: CN102914655A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 曹利平;丁國平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務所(普通合伙) 33221
• 代理人: 冉國政

1.一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟一：

取人體的靜脈血存于-80℃冰箱中待檢測；

步驟二：

?血清MICA蛋白含量的檢測采用western?blot法

a.3ml靜脈全血離心后提取血清1ml，用ELISA法進行蛋白定量，PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合；

b.將上述準備好的樣品液和預染蛋白marker分別上樣，進行變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳分離蛋白；

c.蛋白質轉移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4℃轉移過夜；

d.PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合蛋白，封閉過的膜加入抗MICA一抗，室溫孵育1.5小時，抗原抗體結合，加入HRP標記的二抗,室溫孵育膜1小時；

e.pvdf膜與化學發光底物孵育，經X膠片曝光顯影,圖片掃描保存為電腦文件；

步驟三：

血清或者細胞內MICA?mRNA表達水平的檢測

a.提取RNA:3ml靜脈全血離心后提取血清1ml；

b.逆轉錄合成cDNA第１鏈及第２鏈；

c.將逆轉錄合成的cDNA進行PCR擴增：在50ul的反應體系中加入1ul上述cDNA、2.5ul?Taq酶和2.5ul抗Taq酶，5’端引物序列為ATGCCCCAGTCCTCCAGA，3’端引物為GTGGCATCCC?TGTGGTCA，內參基因選擇為beta-actin，PCR周期設置為94℃變性1分鐘，64℃復性1分鐘，聚合過程45秒，進行30個周期的擴增；采用BigDye?Terminator?Cycle?sequencing?kit?and?Abi?Prism?310?試劑盒測定擴增的DNA產物，與內參基因對比的水平即MICA?mRNA的表達水平。