[發(fā)明專利]一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110223200.X
• 申請日: 2011-08-04
• 公開（公告）號: CN102908617A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李帥偉;龐程
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州格拉姆生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/14;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥基因重組領(lǐng)域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗及制備方法。?

背景技術(shù)

M蛋白是PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中最保守的蛋白，它有一個短肽段(18aa)暴露于病毒粒子表面，可能與病毒的聚集和結(jié)合有關(guān)。M蛋白聚集于粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并與GP5形成異源二聚體，在病毒對肺泡巨噬細(xì)胞附著和病毒侵染過程中起重要作用。M蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，感染后10d即可激發(fā)產(chǎn)生可檢測的抗體應(yīng)答，表達(dá)的重組M蛋白可以作為血清學(xué)試驗(yàn)的靶抗原和亞單位疫苗，M蛋自在細(xì)胞免疫中起重要作用。CD40L具有刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化。此外，它還作用于抗原呈遞細(xì)胞(APC)，促進(jìn)CD28、B7-1和B7-2等免疫共刺激分子的表達(dá)，提高APC的抗原遞呈能力，增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗及制備方法，用于PRRSV感染的預(yù)防及治療。?

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：?

一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗，是一種基因重組融合多肽，該多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列。?

上述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的制備方法，包括以下步驟：?

1)采用基因重組技術(shù)將PRRSV的M基因與CD40L的cDNA基因連接形成融合基因；?

2)將融合基因克隆到原核表達(dá)載體pET30a的克隆位點(diǎn)上，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，液相色譜純化重組融合蛋白。?

本發(fā)明的有益效果為：用重組融合蛋白的混合弗氏免疫佐劑皮下接種豬，檢測特異性IgG抗體和中和抗體滴度，驗(yàn)證重組融合蛋白的體液免疫水平；細(xì)胞免疫是抗細(xì)胞內(nèi)感染免疫的主要形式，此重組PRRSV疫苗通過將M蛋白與CD40L的融合，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗PRRSV的細(xì)胞免疫；免疫后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)可以有效地抑制PRRSV感染，降低受感染的豬的死亡率；此外，該融合蛋白抗原特異性高，不會引起非特異性免疫反應(yīng)，可作為預(yù)防和治療性疫苗在臨床的應(yīng)用。?

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的M蛋白質(zhì)氨基酸序列；?

圖2為本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的M基因核苷酸序列；?

圖3為本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的CD40L蛋白質(zhì)氨基酸序列；?

圖4為本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的CD40L基因核苷酸序列；?

圖5為本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的M-CD40L融合蛋白質(zhì)氨基酸序列；?

圖6為本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的M-CD40L融合基因核苷酸序列。?

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗，是一種基因重組融合多肽，該多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列，所述M蛋白氨基酸序列如附圖1所示，所述CD40L的主要氨基酸序列如附圖3所示；M基因核苷酸序列如附圖2所示，CD40L基因核苷酸序列如附圖4所示，M-CD40L融合蛋白氨基酸序列如附圖5所示，M-CD40L融合基因核苷酸序列如附圖6所示。?

實(shí)施例1M基因克隆到原核表達(dá)載體pET30a?

1、設(shè)計(jì)M基因引物?

參考PRRSV的M基因序列(GenBank號：DQ379480)設(shè)計(jì)擴(kuò)增PRRSV病毒的M基因引物如下，引入酶切位點(diǎn)為EcoR?I和Xho?I(用斜體表示)：?

M-F-E：GC?ATGGGGTCGTCCTTAGATGA，?

M-R-X：GC?TTATTTGGCATATTTGACAAG。?

2、提取PRRS病毒RNA?

Marc-145細(xì)胞感染PRRSV毒株為VR2332，48小時(shí)后(48hpi)，根據(jù)invitrogen公司的RNA提取試劑盒，從感染病毒的Marc-145細(xì)胞中提取總RNA。?

3、PRRSV的M基因的反轉(zhuǎn)錄及PCR?