[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型核酸疫苗及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110221729.8
• 申請日: 2011-08-04
• 公開（公告）號: CN102274523A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設計）人: 陳紅英;崔保安;李新生;魏戰(zhàn)勇;劉金朋;王淑娟;朱前磊;王亞丹;王子馨;李坤
• 申請（專利權）人: 河南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 張紹琳

技術領域

本發(fā)明涉及一種核酸疫苗，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒II型核酸疫苗及其制備方法。

背景技術

豬圓環(huán)病毒(Porcine?circovirus，PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒，有豬圓環(huán)病毒I型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)兩種基因型。豬是PCV2的易感動物，各種年齡、不同性別的豬都可以感染PCV2。常見的仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning?multisystemic?wasting?syndrome，PMWS)主要發(fā)生在哺乳期和育成期的仔豬，尤其是5～12周齡的仔豬，一般于斷奶后2～3天開始發(fā)病。從發(fā)病的季節(jié)來看，一年四季均可發(fā)病，但高峰期在五月，其次是四月和六月。發(fā)病日齡隨著地區(qū)的不同也存在著差異，這與獨特的誘發(fā)因素、母源抗體的水平以及它的下降速度不同都有一定的關系。在疾病感染流行過程中發(fā)病率和死亡率都較低，急性發(fā)病豬群中的死亡率可達10％，在感染PCV2的豬群中常常由于并發(fā)或繼發(fā)細菌或病毒感染而死亡率大大增加。PCV2具有致病性，是PMWS的主要病原，PMWS呈世界性分布，是困擾養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病。PCV2感染后導致豬體的免疫抑制，從而引起繼發(fā)感染，進一步加重PCV2病情，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，PCV2及其所致的相關疾病引起了獸醫(yī)界的高度重視，成為當前研究的熱點。

PCV2為無囊膜的單股環(huán)狀負鏈DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。該病毒無囊膜，病毒粒子直徑為14～25nm，基因組大小為1767bp或1768bp，ORF1和ORF2是最主要的讀碼框。ORF2大小為702bp，編碼233個氨基酸，是病毒的主要結構蛋白(核衣殼蛋白)，具有良好的免疫原，產(chǎn)生的抗體在血清中維持時間長，是構建重組疫苗和檢測的首選基因。Liu等用大腸埃希氏菌表達了ORF2融合蛋白，并證明該表達產(chǎn)物具有很強的免疫原性。

目前在生產(chǎn)中通常采用加強飼養(yǎng)管理、減少應激、做好其他疫病的預防等措施來控制該病的發(fā)生和流行。由于PCV2在體外細胞上增殖滴度不高，毒價測定須借助免疫過氧化物酶單層試驗等，因此用全病毒來制備滅活疫苗或弱毒疫苗操作繁瑣，成本高。而基因工程疫苗如DNA疫苗、亞單位疫苗及病毒活載體疫苗等將是研制PCV2疫苗的主要方向。DNA疫苗作為第3代疫苗，因其既有亞單位疫苗的安全性，又有減毒活疫苗的有效性而受到研究人員的重視，它能誘導機體產(chǎn)生特異性抗體和保護性免疫應答。研究人員對PCV2DNA疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，單一抗原的DNA疫苗攻毒保護力較低。

許多研究表明，細胞因子能夠增強機體對抗原的反應性或增強抗原的免疫原性。白細胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要的細胞免疫調節(jié)因子，它可刺激Th1細胞高水平誘生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等細胞因子，促進T細胞的增殖，顯著增強Th1細胞和NK細胞的細胞毒作用等免疫調節(jié)功能。Muneta等于1999年首次成功克隆出了豬IL-18基因并對其序列進行了初步研究(Muneta?Y，Mori?Y，Shimoji?Y，et?al.Porcine?interleukin18：cloning，characterization?of?the?cDNA?and?expression?with?the?baculovirus?system[J].Cytokine，2000，12(6)：566-572.)。豬IL-18(pIL-18)是目前研究較多的細胞因子佐劑，其良好的免疫增強作用在一些基因疫苗的研究中得到證實。

早在DNA疫苗產(chǎn)生以前就有人把細胞因子作為佐劑與疫苗聯(lián)用，但由于細胞因子在體內半衰期太短且造價昂貴，未能在傳統(tǒng)疫苗中廣泛應用。直接利用大腸桿菌表達的重組豬IL-18作佐劑，也仍有較大困難。一是由于大腸桿菌為原核表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)表達的蛋白存在非糖基化形式和非天然狀態(tài)折疊等缺陷，這使得表達的蛋白分子失去天然結構，因而對重組蛋白的活性還存在爭議；二是要使豬IL-18發(fā)揮佐劑效應，就必須使它到達抗原應答部位，而體外表達的重組豬IL-18被機體轉運至特定部位是極其困難的。真核表達系統(tǒng)則對重組蛋白可進行糖基化、折疊等修飾作用，重組蛋白在結構和生物學活性等方面更接近于天然蛋白，所以真核表達系統(tǒng)在研究中也被廣泛使用。