[發(fā)明專利]克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110220695.0
• 申請日: 2011-08-03
• 公開（公告）號: CN102286606A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙貴明;高旗利;陳穎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院;天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/10
• 分類號: C12Q1/10;G01N21/64
• 代理公司: 隆天國際知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;任曉華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基及檢測方法，屬于食品衛(wèi)生微生物安全檢驗(yàn)與監(jiān)測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

克羅諾桿菌(Cronobacter?spp.)，過去稱作阪崎腸桿菌(Enterobacter?sakazakii)，廣泛存在于自然界中，可通過配方奶粉等食品引起新生兒腦膜炎、敗血癥、壞死性結(jié)腸炎，嬰幼兒感染后病死率高達(dá)20～50％，由此得到了世界衛(wèi)生組織和各國政府及食品工業(yè)領(lǐng)域?qū)＜业母叨戎匾暋４祟惣?xì)菌在1980年被定義和分類為腸桿菌屬的一個(gè)種，即阪崎腸桿菌，2008年被重新分類劃分為一個(gè)新屬，即克羅諾桿菌屬，其包括5個(gè)新種、1個(gè)克羅諾桿菌基因種(genomospeciese)和3個(gè)新亞種(趙貴明等，阪崎腸桿菌的分類變化及新種屬生物學(xué)特性，衛(wèi)生研究，2010年，第39卷，第2期)。目前用于克羅諾桿菌的檢測方法有傳統(tǒng)分離計(jì)數(shù)方法、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等快速方法，但使用最普遍的方法和仲裁方法仍是傳統(tǒng)方法(GB/T?4789.40-2008，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)--阪崎腸桿菌檢驗(yàn))。

傳統(tǒng)方法中，檢測克羅諾桿菌的實(shí)驗(yàn)步驟分為增菌、分離和鑒定三個(gè)部分，增菌步驟包括前增菌和選擇性增菌，前增菌使奶粉中包括目標(biāo)菌在內(nèi)的各種菌均獲得增殖，選擇性增菌則是為目標(biāo)菌提供適宜的生長環(huán)境，同時(shí)盡可能抑制非目標(biāo)菌的生長，以保證獲得足夠數(shù)量的目標(biāo)菌。整個(gè)增菌過程需要約48小時(shí)，接下來是分離和鑒定。陽性樣品的檢測流程為6天，陰性樣品需要3天。快速方法也需要經(jīng)過前增菌和選擇性增菌，陰性樣品也需要3天，如果結(jié)果為陽性，則需要用傳統(tǒng)方法進(jìn)行驗(yàn)證，也為6天(SN/T?1632.3-2005，奶粉中阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)-熒光PCR檢測方法)。

同時(shí)，目前的克羅諾桿菌鑒定培養(yǎng)基是平板培養(yǎng)基。而前增菌后的培養(yǎng)物所包含的非目標(biāo)菌遠(yuǎn)多于目標(biāo)菌。在這種情況下，使用平板培養(yǎng)基不易于分離鑒定出目標(biāo)菌。因此，現(xiàn)有方法中必須要使用單獨(dú)的選擇性增菌步驟以提高目標(biāo)菌相對數(shù)量。

可見，現(xiàn)有檢測方法和檢測培養(yǎng)基要求使用單獨(dú)的增菌和測試步驟，因此非常耗時(shí)。因此，本領(lǐng)域需要效率更高、操作簡便的培養(yǎng)基用于克羅諾桿菌的檢測。

針對上述問題，本發(fā)明提供了用于檢測克羅諾桿菌的克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基。所述克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基是基于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)理論，將人工合成的酶底物與支持細(xì)菌生長的多種營養(yǎng)物質(zhì)組合使用，在細(xì)菌生長的同時(shí)，通過觀察是否產(chǎn)生熒光對目標(biāo)菌進(jìn)行判斷。本發(fā)明所述的克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基，在選擇性增菌培養(yǎng)基中添加了4-甲基傘形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside，α-MUG)，在選擇性增菌的同時(shí)，通過觀察是否產(chǎn)生熒光。利用本發(fā)明的克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基和檢測方法，在48小時(shí)內(nèi)即可得出初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比目前的標(biāo)準(zhǔn)方法和快速方法早1天獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具有高效、快速、低廉、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基和用于檢測克羅諾桿菌的方法，從而在增菌過程的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對克羅諾桿菌的鑒別，顯著縮短了檢測克羅諾桿菌所需的時(shí)間。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了使用包含α-MUG的克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基檢測食品中克羅諾桿菌的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)前增菌步驟：將所述食品置于無菌蒸餾水或緩沖蛋白胨水中，混合均勻后，在35～44℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；和

(2)克羅諾桿菌的選擇性培養(yǎng)和鑒定：以300-3000cfu/mL的接種量將前增菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至包含α-MUG的克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基中，在36±1℃培養(yǎng)18～22小時(shí)，并觀察是否產(chǎn)生熒光，

其中所述步驟(2)中產(chǎn)生熒光則表明所述食品為克羅諾桿菌陽性。

所述步驟(2)的最佳培養(yǎng)溫度為36℃。

在所述步驟(2)中使用的包含α-MUG的克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基為包含氮源、碳源、無機(jī)鹽、水和4-甲基傘形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷的克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基。任選地，所述克羅諾桿菌肉湯培養(yǎng)基還包含一種或多種抑菌劑。