[發明專利]鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法

有效

• 申請號: 201110217849.0
• 申請日: 2011-08-01
• 公開（公告）號: CN102276748A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 朱德康;程安春;汪銘書;何明洪;賈仁勇;陳孝躍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;C12S3/02
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及微生物領域，特別涉及鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法。

背景技術

鴨疫里默氏菌病（Riemerella?anatipestifer?infection）是家鴨、火雞和多種其它鳥類的一種接觸傳染性疾病。該病是目前危害世界各國養鴨業最為嚴重的傳染病之一，已在所有的集約化養鴨生產的國家發現，在我國已呈漫延之勢，已經嚴重阻礙了我國養鴨業的發展。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又稱為內毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分之一，主要由3部分組成，由外向內依次為O-特異性多糖、核心多糖和脂質A。O-特異性多糖又稱為O抗原，由低聚糖組成的重復單位，重復單位及鏈的長度取決于細菌的種類，不同細菌O抗原單糖種類、位置、排列順序和空間結構各不相同，形成種的特異性抗原，是血清學分類的結構基礎，具有激活機體免疫系統的作用。O-抗原的差異使之在免疫學和臨床診斷中具有重要意義。核心多糖與O抗原多糖側鏈相連接，由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫氧辛酸（KDO）等組成，所有革蘭氏陰性細菌都有相似結構。脂質A是脂多糖的主要毒性組分，對脂多糖的生物學功能起到了至關重要的作用。但是，目前還沒有一種有效的方法，能提取高純度的脂質A。

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發明內容

本發明的目的在于建立鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法，該方法獲得率高，操作簡單，適用于大規模生產。

為實現上述方案，本發明的技術方案為：

1、鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法,具體包括以下步驟：

A將鴨疫里默氏菌脂多糖溶解于Ph值為4.2~4.6的SDS的乙酸溶液中，并充分溶解，得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液；

B?將步驟A所得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液加熱至默氏菌脂多糖的化學鍵斷裂，得含有脂質A的溶液，分別用蒸餾水和酸化的乙醇洗滌所述含有脂質A的溶液以去除SDS，得酸化乙醇的混合溶液；

C?將步驟B所得酸化乙醇的混合溶液在不低于2000g條件下離心不低于10分鐘取沉淀，用體積分數為90%~95%的乙醇溶液洗滌樣品，在不低于2000g條件下離心不低于10分鐘；

D?將步驟C重復不少于2次后，進行干燥，得白色絨毛狀物質，所述白色絨毛狀物質為鴨疫里默氏菌脂質A。

2、根據1所述的鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法,步驟A中鴨疫里默氏菌脂多糖的制備方法具體為：將鴨疫里默氏菌充分裂解菌體，用熱酚水提取法提取脂多糖，得脂多糖，所述脂多糖為脂多糖粗品。

3.?根據2所述的鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法,步驟A中鴨疫里默氏菌脂多糖的制備方法具體為：將脂多糖粗品用DNA酶和RNA酶處理，再加入蛋白酶K?處理，得脂多糖，所述脂多糖為酶處理脂多糖粗品。

4.?根據3所述的鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法,將所述酶處理脂多糖粗品溶解于蒸餾水中，在不低于8000g條件下離心不低于15min，取上層水相在0℃~4℃且不低于105000g速度下離心不少于4小時，得沉淀，用去離子水溶解沉淀并干燥，得脂多糖，所述脂多糖為脂多糖純品。

5.?根據1所述的鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法,步驟A中SDS的乙酸溶液中，所述SDS的質量分數為10~14%，所述乙酸的濃度為10~15mmol/L，所述鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液中鴨疫里默氏菌脂多糖與SDS的乙酸溶液的用量配比為1mg：100~150μL。

6、根據1所述的鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法,將步驟A所得鴨疫里默氏菌脂多糖的SDS溶液加熱至100℃，分別用蒸餾水和酸化的乙醇洗滌去除SDS，得酸化乙醇的混合溶液。

7.?根據1所述的鴨疫里默氏菌脂質A的提取方法，步驟B中所述酸化的乙醇洗滌為4mol/L的HCl和體積分數為95%的乙醇以體積比為1:4的比例混合而得的混合液。

本發明的有益效果在于：本發明建立的鴨疫里默氏菌脂質A提取方法操作簡單，所得鴨疫里默氏菌脂質A經鑒定純度高，為其結構的解析及進一步闡述其致病機理奠定基礎，為藥物及疫苗研發提供依據。

更多有益效果，將在實施例中體現。

附圖說明

圖1為鴨疫里默氏菌脂多糖SDS-PAGE銀染圖；泳道1為大腸桿菌055:B5脂多糖，泳道2為鴨疫里默氏菌ATCC11845脂多糖

圖2為鴨疫里默氏菌ATCC11845脂質A紅外光譜。

具體實施方式

實施例1　鴨疫里默氏菌ATCC11845脂多糖的制備