[發(fā)明專(zhuān)利]一種制備DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110216792.2
• 申請(qǐng)日: 2011-07-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102304508A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 赫英俊;孫蘭菊;嚴(yán)引娣
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海捷瑞生物工程有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10;C12N15/11;C12Q1/68;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海智信專(zhuān)利代理有限公司 31002
• 代理人: 胡美強(qiáng);沈利

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種制備DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)俗稱(chēng)DNA?Marker，是由一系列已知長(zhǎng)度的DNA片段混合而成，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的一種試劑。通過(guò)將實(shí)驗(yàn)中所得的DNA片段與DNA?Marker在同一塊瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，通過(guò)將樣品片段與DNA?Marker比較，就可以大致估計(jì)出實(shí)驗(yàn)所得的DNA片段的大小。?

DNA?Marker的各條帶通常有兩種制備方案：PCR擴(kuò)增和酶切質(zhì)粒。?

PCR擴(kuò)增的方案就是設(shè)計(jì)多套PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到相應(yīng)大小的DNA片段。然后再對(duì)各片段進(jìn)行純化，定量。最后按比例將各片段混合，就得到了所需的產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增法制備DNA?Marker存在著較大的缺陷，一是擴(kuò)增的體積會(huì)有一定的限制。現(xiàn)在的PCR儀每個(gè)孔最多擴(kuò)增體積不會(huì)超過(guò)70微升，以一臺(tái)PCR儀96孔為例，最多一次可以擴(kuò)增7毫升。更大的量就需要增加PCR儀及進(jìn)行多次擴(kuò)增。二是PCR擴(kuò)增受多種條件影響較大，如儀器，模板，擴(kuò)增用酶，不同批次的引物，及其他試劑，因此不同擴(kuò)增批次之間差異會(huì)較大。三是PCR擴(kuò)增的成功率相對(duì)較低，有較多的時(shí)間所擴(kuò)增的條帶可能有雜帶，或目標(biāo)條帶專(zhuān)一性不太強(qiáng)，所擴(kuò)增的條帶較寬，或擴(kuò)增產(chǎn)率較低，以及其他的不成功情況。?

常規(guī)質(zhì)粒酶切的方法，由于DNA的條帶亮度與其大小有正比例關(guān)系，在一個(gè)質(zhì)粒中各片段酶切后其亮度可能會(huì)有較大差異，大片段比小片段亮。因此會(huì)導(dǎo)致所制備的終產(chǎn)品各條帶之間亮度不均勻。?

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種試劑，而且屬于消耗型的產(chǎn)品，市場(chǎng)用量很大。而DL2000類(lèi)型的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，由100bp，250bp，500bp，750bp(加亮作為指示帶)，1kb，2kb共6條DNA片段組成。它是實(shí)驗(yàn)室中用得最方便，也是使用最多的一種產(chǎn)品，消耗量很大。許多公司都有類(lèi)似的產(chǎn)品出售。由于該DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)中包含了小片段DNA，許多公司均采用PCR的方案進(jìn)行產(chǎn)品制備。由于PCR生產(chǎn)中需要消耗大量人力資源及PCR儀，而且像100bp這種很小的DNA片段采用PCR擴(kuò)增的方案效率特別低，擴(kuò)增后的每個(gè)條帶均需要進(jìn)行純化，并定量。然后再逐條帶進(jìn)行配制調(diào)整，得到最終產(chǎn)物。因而PCR擴(kuò)增中不同批次之間會(huì)存在較大差別，并且很耗費(fèi)人力及試劑，生產(chǎn)流程難于標(biāo)準(zhǔn)化。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備方法過(guò)程煩瑣，批次之間質(zhì)量不穩(wěn)定，難以大規(guī)模生產(chǎn)的不足，提供一種新的制備DL2000類(lèi)型的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，其生產(chǎn)方便，可大規(guī)模生產(chǎn)，各批次之間質(zhì)量穩(wěn)定，DL2000?DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的各條件亮度均一。?

本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案解決了上述問(wèn)題：?

本發(fā)明的第一技術(shù)方案是：一種制備DL2000?DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，采用質(zhì)粒酶切法，包括以下步驟：(1)DL2000?DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)包括6個(gè)DNA片段：100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，將該6個(gè)片段分配到兩個(gè)載體中進(jìn)行擴(kuò)增，并且使它們?cè)谳d體中具有特定的拷貝數(shù)，其中該6個(gè)片段的分配和拷貝數(shù)具體如下：載體1中包含片段100bp，拷貝數(shù)10；片段250bp，拷貝數(shù)4；片段500bp，拷貝數(shù)2；片段750bp，拷貝數(shù)1；和片段1kb，拷貝數(shù)1；載體2中包含2kb，拷貝數(shù)1；和片段750bp，拷貝數(shù)4；(2)將載體1和載體2用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后混合，即得。?