[發(fā)明專利]鑒別廣東蟲草的特征性核苷酸序列、核酸分子探針和方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110212383.5
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102286621A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李挺;宋斌;李泰輝
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;潘偉健

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測中藥材真?zhèn)蔚募夹g(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于鑒定廣東蟲草(Cordyceps?guangdongensis?T.H.Li，Q.Y?Lin?&?B.Song)的特征性核苷酸序列以及核酸分子探針和鑒定廣東蟲草的方法。

背景技術(shù)：

冬蟲夏草(蟲草)是中國名貴中藥材，具有保肺腎、補(bǔ)精益髓、化痰止咳的作用，常食可促進(jìn)消化、調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)人體抵抗力，市場需求日益增大。但隨著人們的過度采集，使得野生蟲草資源日益稀缺，幾近瀕危，價格大幅上升，形成惡性循環(huán)。冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體以及蛹蟲草(菌絲體和子實體)的商業(yè)化生產(chǎn)緩解了蟲草市場的壓力，具有較好的市場潛力。廣東蟲草(Cordyceps?guangdongensis?T.H.Li，Q.Y?Lin?&?B.Song)是新發(fā)現(xiàn)的中國特有蟲草新品種，于2006年5月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，保藏號為CCTCCNO.M206051，該蟲草安全無毒可食，具有較好的抗氧化活性、抗疲勞和延壽作用。廣東蟲草的蟲草素和腺苷含量雖比蛹蟲草低、但比冬蟲夏草高，其蟲草酸含量與冬蟲夏草比較接近，具有較好的開發(fā)應(yīng)用價值。因此，快速且準(zhǔn)確地鑒別廣東蟲草及其相關(guān)制品真?zhèn)蔚姆椒ê图夹g(shù)是廣東蟲草商業(yè)化生產(chǎn)的重要技術(shù)，對廣東蟲草的商業(yè)生產(chǎn)與檢驗具有重要的意義。

DNA是生物遺傳信息的載體，每個生物物種乃至個體均具有獨特的特征性核苷酸序列，且具有一定的穩(wěn)定性，不會受到環(huán)境或培養(yǎng)等條件的影響而改變，是該生物物種或個體區(qū)別于其它生物物種或個體的重要標(biāo)志，因而是用來鑒定物種或個體的可靠依據(jù)。利用分子生物學(xué)技術(shù)與手段對物種或個體的特征性序列進(jìn)行分析研究，從而可以準(zhǔn)確地對該特征性核苷酸序列進(jìn)行探測則可快速和準(zhǔn)確地對該物種或個體進(jìn)行鑒別。目前，已有用于鑒別冬蟲夏草、蜂頭蟲草等的核苷酸特征序列獲得專利，但尚未見與廣東蟲草鑒定相關(guān)的核苷酸特征性序列的專利。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種利用分子生物學(xué)手段，從遺傳本質(zhì)上鑒別廣東蟲草及其相關(guān)制品真?zhèn)蔚奶卣餍院塑账嵝蛄小?/p>

本發(fā)明的用于鑒別廣東蟲草的特征性核苷酸序列來源于廣東蟲草的核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1、ITS2和它們之間的5.8S?rDNA基因，具體序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種以鑒別廣東蟲草及其相關(guān)制品真?zhèn)蔚奶卣餍院塑账嵝蛄?SEQ?ID?NO.1)為基礎(chǔ)設(shè)計的用于鑒別廣東蟲草的核酸分子探針，該核酸分子探針序列如下：

GDF：5`-CTGTTGGCATCTTCTGAGTCTC-3`；

GDR：5`-GGTGCGAGGTTGTGCTACTA-3`。

上述核酸分子探針序列GDF和GDR，它們的退火溫度相近，均不能形成引物二聚體。該核酸分子探針具有極高的專一性，僅與廣東蟲草發(fā)生反應(yīng)，而不與其他蟲草或其他真菌反應(yīng)。利用該探針通過PCR擴(kuò)增可以快速的對廣東蟲草(菌絲體、子實體)及其相關(guān)制品進(jìn)行鑒別。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種廣東蟲草快速鑒定試劑盒，包括上述核酸分子探針GDF和GDR，以及常規(guī)的DNA提取試劑和常規(guī)的PCR反應(yīng)試劑。

所述的廣東蟲草快速鑒定試劑盒優(yōu)選包括蟲草屬真菌核糖體rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`和ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`。該通用引物可以作為鑒定廣東蟲草的陽性對照。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種鑒別廣東蟲草的方法，是采用上述核酸分子探針GDF和GDR作為PCR引物，利用PCR方法鑒定廣東蟲草，具體步驟按常規(guī)PCR方法進(jìn)行。

優(yōu)選，利用ITS1和ITS4作為PCR引物，以廣東蟲草的基因組DNA作為模板進(jìn)行常規(guī)的PCR，以作為陽性對照。