[發明專利]一種雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備和應用

有效

• 申請號: 201110212212.2
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102277374B
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 徐素珍;藍勝芝;趙艷敏;黃芳;吳桃芬
• 申請（專利權）人: 浙江諾倍威生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;A61K39/12;A61P31/14;C12N15/40;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物工程和免疫學領域；更具體地，本發明涉及一種雞傳染性 法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備和應用。

背景技術

傳染性法氏囊病(Infectious?bursal?disease，IBD)是一種由傳染性法氏囊病病 毒(Infectious?bursal?disease?virus，IBDV)引起的急性、高度接觸性傳染病，常導 致雞群的大量死亡，同時導致免疫抑制，使得雞群疫苗接種免疫失敗和繼發、 并發疾病大量增加，造成嚴重的經濟損失。該病已成為危害我國養雞業最嚴重、 最棘手的傳染病，目前沒有特效藥物治療。

目前常用的防治手段是疫苗接種，包括減毒疫苗和滅活疫苗，但自IBDV 發現至今，新的變異株、強毒株、超強毒株不斷出現，分子結構的改變導致病 毒致病力的改變及宿主對疫苗應答的改變，使得傳統的疫苗已不能控制其流 行，給疾病的預防與治療帶來新的困難與挑戰。近年來，我國養雞業發展迅速， 特別是規模化養雞場的增多、養雞生產水平的提高，每年法氏囊病疫苗的需求 也迅速增長，因此急需開發出一種安全有效的產品，能夠在低成本條件下大規 模生產應用，以最快速度預防，控制病毒的傳播，從而保障養殖業的健康發展。

隨著分子生物學技術的發展，對病毒基因結構與功能的研究深入，傳染性 法式囊病病毒基因重組研制日趨成熟，基因工程疫苗已經是國內外發展的主要 方向。綜合比較各種基因工程疫苗，其中尤以蛋白亞單位疫苗更具獨特的優勢。 蛋白亞單位疫苗絕不含活毒成分，生產和使用過程無散毒可能，消除了污染的 可能性，是值得積極推廣使用的安全疫苗。

在先專利《200410080065.8，一種傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的 制備方法和應用》中，亞單位疫苗能夠刺激機體產生中和抗體并有效抵抗病毒 的攻擊，但是原核表達系統需要對細胞沉淀進行多次凍融超聲破碎等繁雜的程 序，以及存在細菌體內可能殘留內毒素的危險，在生產工藝流程簡化以及疫苗 的安全性方面受到了限制。

在先專利《200510135583.X，雞傳染性法氏囊病病毒VP2cDNA、其表達 載體、所表達的重組蛋白及應用》中，將目的基因VP2進行了人工改造、全基 因序列合成后在酵母中表達。但是，該專利中表達的目的蛋白C端殘留有載體 上的一段序列，不具有天然性，且影響了其免疫原性。

因此，仍然需要改良雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備技術， 以提高表達量，獲得免疫原性強的疫苗。

發明內容

本發明的目的在于提供一種雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位(VP2)疫苗 的制備和應用。

在本發明的第一方面，提供一種重組表達雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白 亞單位的方法，該方法包括：

(1)提供改造的VP2蛋白亞單位編碼基因；其中，在所述的VP2蛋白亞單 位編碼基因的5’端起始密碼子ATG之前添加蛋白酶KEX2的切割序列，在所 述的VP2蛋白亞單位編碼基因的3’端添加終止密碼子序列；

(2)將(1)所述的VP2蛋白亞單位編碼基因插入到酵母表達載體pPICZαA 的α-factor信號肽編碼序列下游，獲得重組表達載體；

(3)將(2)的重組表達載體轉化畢赤酵母，獲得重組的畢赤酵母細胞；

(4)將(3)的重組的畢赤酵母細胞進行重組表達，從表達上清中獲得雞傳染 性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位。

在另一優選例中，步驟(1)中，還在所述的蛋白酶KEX2的切割序列的5’ 端之前添加XhoI酶切位點序列；在所述的終止密碼子序列的3’端添加NotI 酶切位點序列。

在另一優選例中，步驟(2)中，將所述的VP2蛋白亞單位編碼基因插入到 酵母表達載體pPICZαA的XhoI/NotI酶切位點之間。

在另一優選例中，所述的改造的VP2蛋白亞單位編碼基因的序列如SEQ?ID NO：1所示。

在另一優選例中，所述的畢赤酵母是X-33菌株。

在另一優選例中，將重組表達載體電轉化畢赤酵母，電轉化條件為：0.2cm 電轉杯，電壓2.0KV，電擊時間5ms，質粒濃度為7-10ug/10μL，感受態細胞 100μL；電轉化后快速加入1mL?1M山梨糖醇，30℃復蘇1小時。