[發明專利]一種懸浮細胞的免疫熒光染色方法

無效

• 申請號: 201110211736.X
• 申請日: 2011-07-27
• 公開（公告）號: CN102288471A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 孫璨;朱勇;楊施;胡洪亮;李錚
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 巫蓓麗

技術領域

本發明涉及一種細胞染色方法，具體地說，是一種懸浮細胞的免疫熒光染色方法。

背景技術

對于傳統的細胞免疫熒光染色，通常采用細胞爬片或者直接涂片等方法來預處理細胞，再進行免疫熒光染色。而對于懸浮生長的細胞或細胞團，采用細胞爬片處理時，常會出現貼壁狀態不佳或在玻片兩面都同時生長的情況，影響后期的染色和觀察；此外，在后續的染色過程中，附著于爬片的細胞經過多次沖洗后，容易脫落。

中國專利文獻CN101329230B公開了一種改進的免疫熒光細胞染色方法，包括固定/通透、通透、表面染色和核內染色、洗滌、重懸共5個步驟，是對eBioscience公司的Foxp3免疫熒光細胞染色方法的改進，將二步多重染色法改為一步多重染色法，同時進行細胞表面染色和核內染色。中國專利文獻CN101226118公開了一種兼容免疫熒光分析的細胞化學染色方法，涉及一種兼容免疫熒光分析的細胞化學染色方法及其用途。中國專利文獻CN102043047A公開了一種基于細胞爬片的快速經濟的免疫熒光方法。但是關于一種懸浮細胞的免疫熒光染色方法目前還未見報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種懸浮細胞的免疫熒光染色方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：一種懸浮細胞的免疫熒光染色方法，所述的染色方法包括以下步驟：先收集細胞于離心管中，800g離心收集細胞，然后分別加入多聚甲醛（PFA）固定、Triton-X100通透、1%?BSA封閉，再依次加入一抗、二抗孵育，以上每步操作后都采用800g離心的方法進行洗滌，最后DAPI染色后，滴至載玻片上封片觀察。

所述的染色方法包括以下步驟：

a、收集細胞或大細胞團（細胞總數為10⁶-10⁷）于2ml離心管中；

b、加入2ml?PBS，溫和上下顛置，800g離心5min，棄上清；

c、重復b步驟，去除培養基中血清的影響；

d、加入2ml蒸餾水，溫和上下顛置，800g離心5min，棄上清；

e、加入1ml?4%?多聚甲醛，放置10min；其間每隔2min輕彈管底數次，使細胞充分接觸溶液；800g離心5min，棄上清；

f、重復b、c、d步驟；

g、加入1ml?0.4%?Triton-X-100通透細胞，放置10-20min；其間每隔5min輕彈管底數次，使細胞充分接觸溶液；800g離心5min，棄上清；

h、重復b、c、d步驟；

i、加入1ml?1%?BSA或山羊血清，室溫放置30min，以封閉細胞表面的非特異性抗原；其間每隔5min輕彈管底數次，使細胞充分接觸溶液；800g離心5min，棄上清；

j、加入一抗，室溫放置2h或者4℃過夜；

k、重復b、c、d步驟；

l、避光加入熒光標記的二抗，室溫放置1h；

m、重復b、c、d步驟；

n、加入DAPI和10ul蒸餾水，室溫避光放置5min；

o、用移液器將細胞滴至載玻片上，晾干，加含抗熒光淬滅劑的封片劑封片。

所述的細胞為懸浮細胞。

本發明優點在于：

本發明的一種懸浮細胞的免疫熒光染色方法，免疫熒光染色的過程均在離心管中進行，避開了懸浮細胞難于爬片及試驗過程容易脫落的問題，染色結果較好，對于懸浮細胞及難于貼壁的細胞，此方法十分適用。

附圖說明

附圖1是RA誘導后的EB細胞DAPI染核的熒光圖片。

附圖2是本身帶有GFP的RA誘導后的EB細胞熒光圖片。

附圖3是對RA誘導后的EB細胞進行VASA染色的熒光圖片。

附圖4是圖1、圖2、圖3的疊加。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。

附圖中涉及的附圖標記和組成部分如下所示：

實施例1??

一、實驗材料

細胞：小鼠iPS細胞(induced?pluripotent?stem?cells，誘導多能干細胞)，細菌培養皿懸浮培養5天形成的擬胚體（EB）后，添加2um的維甲酸（RA）培養2天后的誘導分化的EB細胞。