[發(fā)明專利]降解樂果、氯苯胺靈和敵稗的酰胺酶基因dimtH及其編碼的蛋白質(zhì)及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110208381.9
• 申請日: 2011-07-25
• 公開（公告）號: CN102268396A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 何健;李順鵬;張雋;殷金崗;杭寶劍
• 申請（專利權）人: 南京農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/55;C12N9/80;C12N15/63;C12N1/21;C12N15/82;A01H5/00;A62D3/02;C02F3/00;B09C1/10;C12R1/01;C12R1/19;A62D101/04;A62
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

技術領域

本發(fā)明屬于應用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領域，涉及降解樂果、氯苯胺靈和敵稗的酰胺酶基因dimtH及其編碼的蛋白質(zhì)及其應用。

背景技術

我國人多地少，大量使用化學農(nóng)藥是保證作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的必要措施，但同時也帶來嚴重污染。據(jù)中科院土壤所檢測數(shù)據(jù)表明，由于主施農(nóng)藥的難降解性，導致土壤和農(nóng)作物殘留率較高，如目前在長三角和珠三角農(nóng)田土壤檢出率達90％以上，受農(nóng)藥污染的農(nóng)產(chǎn)品更是如此，如國際綠色和平組織2009年檢測結果表明，我國90％農(nóng)產(chǎn)品檢出農(nóng)藥殘留，66％的樣品殘留至少5種以上農(nóng)藥，2010年4月份發(fā)生的青島毒韭菜事件就是有機磷殺蟲劑污染導致的，造成了惡劣影響。此外我國每年除草劑藥害面積達3000萬畝，其中嚴重藥害面積達到500萬畝，每年造成幾十億元的損失。微生物修復技術是一種新型原位生物修復技術，具有效果好，費用低，無二次污染，適合大面積面源污染修復等優(yōu)點，是土壤有機污染物修復技術的主流和發(fā)展方向。

殺蟲劑樂果和除草劑氯苯胺靈、敵稗等是含酰胺鍵的農(nóng)藥，在我國使用廣泛，目前能降解殺蟲劑樂果和除草劑氯苯胺靈、敵稗這幾種農(nóng)藥的降解性微生物菌株已經(jīng)有報道，但能降解這幾種農(nóng)藥的降解基因還未見報道。獲得殺蟲劑樂果和除草劑氯苯胺靈、敵稗等含酰胺鍵農(nóng)藥的降解基因在治理農(nóng)藥殘留，消除其藥害技術研發(fā)中具有以下作用和功能，(一)通過現(xiàn)代生物技術將降解基因導入作物構建相應的除草劑抗性轉基因作物，(二)通過現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術將降解菌株和基因制成降解菌劑或酶制劑將土壤中農(nóng)藥殘留降解。此外降解基因還可用于有用化工產(chǎn)品及藥物合成的生物轉化。因此降解基因在消除該類除草劑藥害及生物轉化領域中具有非常重要的理論和應用價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供降解樂果、氯苯胺靈和敵稗的酰胺酶基因dimtH及其編碼的蛋白質(zhì)及其應用。該酰胺酶基因可用于構建降解殺蟲劑樂果和除草劑氯苯胺靈、敵稗的轉基因作物，土壤、水體中殺蟲劑樂果和除草劑氯苯胺靈、敵稗殘留的去除。

本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：

副球菌Dimd-2(Paracoccus?sp.)，保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?M?2011234，保藏日期為2011年7月4日。

一種酰胺酶基因dimtH，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。

本發(fā)明酰胺酶基因dimtH克隆自篩選得到的一株能夠降解樂果、氯苯胺靈和敵稗的副球菌Dimd-2(Paracoccus?sp.)。菌株Dimd-2保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?M?2011234，保藏日期為2011年7月4日，質(zhì)譜分析結果表明菌株Dimd-2的粗酶液可以把殺蟲劑樂果和除草劑氯苯胺靈、敵稗的酰胺鍵斷裂而降解這些靶標農(nóng)藥。

克隆降解樂果、氯苯胺靈和敵稗的酰胺酶基因的采取的策略為鳥槍法(見圖1)，采用一種含酰胺鍵化合物對乙酰氨基酚作為目標酰胺酶的篩選標記，對乙酰氨基酚(無色)在酰胺酶催化下其酰胺鍵斷裂生成褐色的對氨基苯酚。首先提取菌株Dimd-2(CCTCC?M?2011234)的總DNA，總DNA采用Sau3AI部分酶切后和BamHI用酶切的質(zhì)粒pUC118酶連，酶連產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞構建菌株Dimd-2的總DNA文庫，把構建好的文庫轉化到大腸桿菌DH5α中，含有能降解樂果、氯苯胺靈和敵稗的酰胺酶基因的克隆子菌落能在含有乙酰氨基酚的LB平板上產(chǎn)生褐色色素。利用這種克隆方法可以對文庫進行高通量的篩選。

用上面的策略篩選鳥槍法構建的基因文庫獲得一個能在加入100ppm乙酰氨基酚的LB平板上產(chǎn)生褐色色素的克隆子，進一步的降解實驗表明該陽性克隆子能降解樂果、氯苯胺靈和敵稗。測序結果表明該陽性克隆子含有2,585bp，其中包含有12個潛在的ORF(大于150bp)，對這些潛在的ORF分別進行亞克隆和序列比對分析，最后確定編碼目標酰胺酶的基因的大小為1395bp，命名為dimtH。這是首次克隆到能降解樂果、氯苯胺靈和敵稗的酰胺酶基因。

所述的酰胺酶基因dimtH所編碼的酰胺酶DimtH，其氨基酸序列為：SEQ?ID?NO.2。

含有所述的酰胺酶基因dimtH的重組表達載體。

優(yōu)選將權利要求1所述的酰胺酶基因dimtH插入pET-29a(+)的NdeI和EcoRI位點之間所得。

含有所述的酰胺酶基因dimtH的基因工程菌。

所述的基因工程菌的出發(fā)菌株為大腸桿菌BL21(DE3)。