[發(fā)明專利]冬蟲夏草菌無性階段菌種分離的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110206315.8
• 申請日: 2011-07-22
• 公開（公告）號: CN102283022A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹定華;曾緯;陳仕江;劉飛;涂永勤;張德利;李黎;馬開森;羅慶明;錢敏
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶市中藥研究院
• 主分類號: A01G1/04
• 分類號: A01G1/04;C05G1/00
• 代理公司: 重慶輝騰律師事務(wù)所 50215
• 代理人: 侯懋琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種菌種分離方法，更具體的說涉及一種從蝙蝠蛾幼蟲活體上分離冬蟲夏草菌的方法。

技術(shù)背景

冬蟲夏草是一種傳統(tǒng)的名貴滋補中藥材，與天然人參、鹿茸并列為三大滋補品。其藥性溫和，一年四季均可食用，老、少、病、弱、虛者皆宜，比其他種類的滋補品有更廣泛的藥用價值．國內(nèi)外需求與日俱增。冬蟲夏草是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段（無性型）和子囊孢子階段（有性型）。在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產(chǎn)中使用的冬蟲夏草菌種均為無性階段，其菌種的正確鑒定至關(guān)重要，故而其無性型問題特別引人關(guān)注。目前，已報道的冬蟲夏草無性型菌種有22個學(xué)名，涉及13個屬。文中按國際植物命名法的規(guī)定，分為兩類：合格發(fā)表的新種名稱（6種）和不合格發(fā)表或作為異名的名稱（9種）；文中按作者的謹慎判斷，又分為四類：不可能是冬蟲夏草無性型的名稱（3種）、可能不是冬蟲夏草無性型的名稱（2種）、與冬蟲夏草的關(guān)系有待驗證的名稱（12種）、目前可以確認為冬蟲夏草無性型的名稱（6種）。近年來分子生物學(xué)方法多次被應(yīng)用于驗證冬蟲夏草的無性型，在菌種驗證方法上，全世界公認的、最可靠的是按照柯赫法則（Koch's?postulate），分離的菌株經(jīng)過人工培養(yǎng)或接種昆蟲后能夠形成冬蟲夏草有性型子實體，產(chǎn)生子囊孢子，才可以確定其是冬蟲夏草的正確無性型。沈南英分離的菌株在人工培養(yǎng)基上，唯一能夠形成冬蟲夏草有性型子座，產(chǎn)生子囊孢子，并獲得專利（專利號：ZL85101971）而可以確認無疑是冬蟲夏草的正確無性型菌種，后來該菌種被確名為中國被毛孢菌。中國被毛孢與冬蟲夏草DNA指紋圖譜相似率高達96?%，而通過rDNA的ITS區(qū)段序列比較分析，多個獨立研究結(jié)果都支持該菌為冬蟲夏草的無性階段。另外，通過微循環(huán)產(chǎn)孢實驗也支持中國被毛孢為冬蟲夏草的無性型。

傳統(tǒng)的方法是孢子分離法和組織分離法?，但這兩種方法都有一定的缺陷。孢子分離法要在野外獲得子囊孢子剛成熟的子實體很不容易，且收集程序繁雜、在其過程中極易污染，要獲得單個孢子更是困難。因此用該是方法分離培養(yǎng)很難獲得冬蟲夏草的純菌株。組織分離法不僅生長速度慢，且在分離過程中雜菌種類多、污染率極高，不易獲得冬蟲夏草的純菌株，正因如此，八十年代以來國內(nèi)多家單位各自分離出的菌株名稱不一、形態(tài)各異，但都認為自已分離的是真正的冬蟲夏草菌株，真實情況卻是大多數(shù)報道的均非真正的冬蟲夏草菌，一時間，形成了嚴重的對冬蟲夏草菌無性階段菌種認識的混亂局面。

發(fā)明內(nèi)容

通過研究發(fā)現(xiàn)，中國被毛孢菌生長緩慢，氣生菌絲不發(fā)達，菌落堅硬，通過培養(yǎng)?，已多次在固體培養(yǎng)基上形成子座，光照處理后在子座上形成子囊孢子，這些人工培養(yǎng)產(chǎn)生的子囊果、子囊孢子被認為與冬蟲夏草天然的子囊果、子囊孢子形態(tài)特征完全一樣。因此基本可以確認中國被毛孢為冬蟲夏草的無性型。本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草菌無性階段菌種分離的方法，即從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體的體液中分離中國被毛孢菌無性階段菌種。

所述從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲，活體中分離中國被毛孢菌的具體步驟為：

1）篩選感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體，體表消毒；

2）微創(chuàng)蝙蝠蛾幼蟲體表，將體表滲透出的體液置于平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

3）在8～18℃條件下培養(yǎng)9～16天，期間，汰除雜菌，留下蟲草菌繼續(xù)培養(yǎng)，得到中國被毛孢菌。

所述步驟2）所述的平板培養(yǎng)基的配方為：水1000毫升中、鮮馬鈴薯塊200g、葡萄糖200g、瓊脂20?g、蛋白胨15?g、硫酸鎂0.5?g、磷酸二氫鉀0.5g、酵母粉5g，其中平板培養(yǎng)基的pH為6.5～7。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體的體液中分離中國被毛孢菌，一頭感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體，可多次用于分離培養(yǎng)冬蟲夏草菌的無性階段菌種。相對孢子分離法和組織分離法操作更加簡單，雜菌污染率低，節(jié)約生物材料，被提取過體液的蝙蝠蛾幼蟲通過繼續(xù)飼養(yǎng)，還可長出冬蟲夏草。實現(xiàn)了冬蟲夏草培育過程中生物繁殖材料的循環(huán)利用。

附圖說明

圖1：本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)的蝙蝠蛾幼蟲的出土20天的蟲草；

圖2：野生感菌幼蟲出土20天的蟲草；

圖3：本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)的蝙蝠蛾幼蟲的的子囊殼發(fā)育成熟的蟲草；

圖4：野生感菌幼蟲子囊殼發(fā)育成熟的蟲草。

具體實施方式