[發明專利]一種毛栓菌及其產纖維素酶的方法

無效

• 申請號: 201110202609.3
• 申請日: 2011-07-10
• 公開（公告）號: CN102268379A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 賈翠英;張玉輝;朱黎婭;趙俊杰;華承偉;趙婭珺
• 申請（專利權）人: 賈翠英
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/42;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種毛栓菌(Trametes?trogii)Cellulase?1號及其產纖維素酶的方法。該菌株保藏號為CGMMC?No.4587；該菌株以玉米芯，玉米秸稈，小麥麩皮為主要原料，添加適量可利用碳源如葡萄糖或淀粉等，以及添加適量可利用氮源如硫酸銨、酵母膏或蛋白胨等進行靜置或兼性厭氧發酵產纖維素酶。

二、背景技術

纖維素廣泛存在于自然界中，是地球上最豐富的可再生資源，被開發利用的纖維素全世界不足2％，我國約有50％以上作物秸稈被直接焚燒，嚴重污染了環境同時也造成資源的極大浪費。將纖維素降解為小分子可溶性糖，然后利用微生物轉化為有機酸、醇、醋及甲烷、氫氣等化工原料和能源，對解決當今所面臨的能源危機、資源匱乏和環境污染問題具有重大的現實意義。

纖維素酶是一組能夠將纖維素分解成纖維二糖、葡萄糖等可溶性糖的酶的總稱。纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、微生物都能產生纖維素酶，其中微生物發酵生產纖維素酶是一種非常有效的方法。目前，微生物發酵產纖維素酶菌種主要集中在曲霉屬如黑曲霉、根霉屬如米根霉、木霉屬如綠色木霉，里氏木霉，康氏木霉，康寧木霉等，而這些微生物在進行纖維素酶發酵生產時主要采用的是好氧發酵，需要攪拌，消耗大量能量，此外，目前所報道的產纖維素酶菌株發酵周期多數為5-7天。

利用所分離、篩選和鑒定的毛栓菌(Trametes?trogii)進行靜置或兼性厭氧發酵產纖維素酶是首創，國內外未見報道。靜置或兼性厭氧發酵產纖維素酶很大程度上降低了發酵過程中的攪拌電力消耗，節省了能源，此外，該菌株發酵周期相對較短，所產酶活相對較高，一定程度實現了較高的生產效率，具有很好的潛在應用價值。

三、發明內容

本發明目的是利用所篩選并經鑒定的一株毛栓菌(Trametes?trogii)進行纖維素酶的靜置或兼性厭氧發酵，降低發酵過程中的能源消耗，縮短發酵周期，提高纖維素酶發酵的生產效率。

本發明的具體技術方案：

1.一種毛栓菌cellulase?1號的分離與鑒定：

取來自于小莊農戶家中剛宰殺的羊瘤胃液1mL，置于100mL無菌水的三角瓶中，搖勻，從中取1mL菌液，10倍梯度稀釋為10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，分別取10^-5和10^-6兩個稀釋倍數的稀釋液0.1ml涂布到PDA培養基上，30℃～37℃培養3～4天；

待PDA培養基上長出菌落后，分別挑取單菌落，接種到復篩培養基上(其組成為CMC-Na10g/L，硫酸銨4g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.5g/L，蛋白胨1g/L，瓊脂18g/L，pH自然)，30℃～37℃培養3～4天(圖1)；

將復篩得到的菌落，采取平板點種法接種到纖維素剛果紅培養基中，30℃～37℃培養4天，無菌水緩慢沖洗平板至流出水為無色，加入適量1mol/L氯化鈉溶液浸泡30分鐘洗滌，觀察水解圈，選擇水解圈較大的菌落(圖2)，并對該菌株進行rRNA序列測定，經鑒定為毛栓菌(Trametes?trogii)，菌株編號為Cellulase?1號，其特征是菌落在麥芽浸膏瓊脂(MEA)培養基上菌落生長迅速，黑暗條件下25℃培養14天，菌落直徑75-85mm，白色，絮狀，平鋪；背面淺褐色，無水溶性色素(圖3)。菌絲壁平滑或稍粗糙，多分枝，具分隔，1.5-4.5μm寬，未見鎖狀聯合現象，未見任何類型孢子(圖4)。該菌株已于2011年5月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.4857。

2.一種毛栓菌Cellulase?1號產纖維素酶方法：

將玉米芯或玉米秸稈或小麥秸稈粉碎過40目，稱量2.5g～12.5g裝入250ml三角瓶中，加入50ml～100ml自來水，加入1％～10％淀粉或葡萄糖等可利用性碳源和0.1％～0.5％硫酸銨或蛋白胨或酵母膏等可利用性氮源，115℃高壓滅菌15～20min后，冷卻，無菌操作，接入在復篩培養基上已培養3～4天的Cellulase?1號菌株的菌餅5～8塊，菌餅直徑8mm，30℃～37℃靜置或兼性厭氧發酵3～4天，發酵液3000～3500rpm離心10～15min，取上清為粗酶液。(圖5)

3.纖維素酶活測定、酶活定義與計算方法：