[發明專利]農桿菌介導的玫瑰遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201110202403.0
• 申請日: 2011-07-19
• 公開（公告）號: CN102286523A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 寧國貴;邢文;包滿珠;包穎
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 涂潔

技術領域

本發明屬于植物轉基因技術領域，具體涉及一種以‘唐白’品種為例，以繼代增殖的體細胞胚為轉化受體材料，通過農桿菌介導進行玫瑰遺傳轉化的方法。

背景技術

玫瑰(Rosa?rugosa)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)落葉直立叢生灌木，原產中國北部，其色艷花香，含油量高，是我國重要的經濟植物，也是世界上重要的觀賞與生產兩型花卉之一。但玫瑰一年只開一次花，且花期不長，無法滿足市場的需由。采用傳統的雜交育種的方法選育新品種，周期長，工作量大，并且會受到育種材料自身變異的限制，改良幅度有限。隨著生物技術的快速發展，植物細胞工程和基因工程技術日趨成熟，可以在保持品種的其他性狀相對穩定的基礎上，利用外源基因對其所控制的性狀進行定向改良，提高了育種的效率，從而為培育玫瑰新品種提供了新的途徑。

玫瑰遺傳轉化的研究是基因工程育種的基礎，但是目前國內外還沒有玫瑰遺傳轉化成功的報道。

華中農業大學的專利申請“玫瑰再生為完整植株的方法”(申請號為：201110099811.8)，提出以玫瑰未成熟葉片為外植體，通過體細胞胚發生途徑，建立玫瑰再生體系的方法，但其不具有遺化轉化步驟，無法實現品種改良。

發明內容

本發明的目的是為了解決上述技術問題，提供一種以玫瑰未成熟葉片為外植體，以體細胞胚為轉化受體，通過農桿菌介導的玫瑰遺傳轉化的方法，，具有方法簡單、培養周期短的優點。

本發明的農桿菌介導的玫瑰遺傳轉化方法，以玫瑰未成熟葉片誘導得到的體細胞胚為受體，通過農桿菌介導的方法，按下述步驟進行處理：

(1)體細胞誘導：以玫瑰未展開帶葉柄小葉為外植體，將其接種于體細胞胚誘導培養，直接誘導出體細胞胚；

(2)轉化受體的繼代增殖培養：將誘導得到的體細胞胚接種于體細胞胚繼代增殖培養基中繼代增殖培養，為遺傳轉化提供轉化受體材料；

(3)遺傳轉化：將經繼代增殖培養的體細胞胚作為轉化受體材料轉入制備好的農桿菌菌液中進行侵染，所述侵染時間為50-60min；

(4)然后將侵染后的體細胞胚進行共培養，選擇增殖培養、選擇萌發成苗培養，最終獲得玫瑰的轉基因植株。

步驟(1)中所述體細胞胚誘導培養基包括：MS培養基為基礎培養基，并添加2，4-D?3.0-4.0mg/L、葡萄糖30.0g/L、GEL?3.0mg/L，加蒸餾水至1L，pH?6.0。

步驟(2)中所述體細胞胚繼代增殖培養基包括：MS培養基為基礎培養基，并添加2，4-D?1.0mg/L、葡萄糖30.0g/L、GEL?3.0mg/L，加蒸餾水至1L，pH?6.0，每4周更新一次培養基，并選擇在更新的體細胞繼代增殖培養基中培養了2周的體細胞胚作為遺傳轉化的受體；所述培養條件為：溫度24±2℃、光照強度為50-100lx。

所述步驟(3)中侵染時間為60min。

所述步驟(4)中，先將侵染后的體細胞胚轉入共培養培養基中，在24±2℃、黑暗條件下進行共培養，共培養2天后轉入體細胞胚選擇增殖培養基在24±2℃、光照強度為50-100lx條件下進行選擇增殖培養10周，每2周更新一次培養基，篩選得到抗性體胚；將在選擇增殖培養基中篩選得到的抗性體胚轉入選擇萌發成苗培養基中，每三周更新一次培養基，在24±2℃、光照強度為1000-1500lx下萌發成苗，最終獲得玫瑰的轉基因植株。

所述共培養培養基包括：MS培養基為基本培養基、添加2，4-D1.0mg/L，AS?100μmol/L，葡萄糖30.0g/L，GEL?3.0mg/L，加蒸餾水至1L，pH?5.8；所述體細胞胚選擇增殖培養基包括：MS培養基為基本培養基，并添加2，4-D?1.0mg/L，Km75-100mg/L，Cef300mg/L，葡萄糖30.0g/L，GEL?3.0mg/L，加蒸餾水至1L，pH?6.0；所述選擇萌發成苗培養基包括：1/2MS培養基為基本培養基，并添加BA1.0，Km?75mg/L，Cef?300mg/L，葡萄糖30g/L，GEL?3.0mg/L，加蒸餾水至1L，pH?6.0。

所述的Km是卡那霉素(Kanamycin)：用無菌蒸餾水配制成100mg/L的母液，Cef是頭孢霉素(Cefotaxime)：用無菌蒸餾水配制成200mg/L的母液，AS是乙酰丁香酮：稱取一定量的AS，用甲醇溶解，最后用無菌蒸餾水定容，配制成10μmol/ml的母液，以上三種生化試劑均采用0.45μm濾膜過濾滅菌，于-20℃保存；