[發明專利]山羊痘反向間接血凝診斷試劑及其制備方法和檢測方法

無效

• 申請號: 201110166981.3
• 申請日: 2011-06-21
• 公開（公告）號: CN102253197A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 劉忠偉;周碧君;程振濤;文明;王開功;嵇辛勤;岳筠;汪德生
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/569
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 程新敏;顧書玲

技術領域

本發明涉及反向血凝診斷試劑技術領域，特別是涉及一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑及其制備方法和檢測方法。

背景技術

山羊痘是由山羊痘病毒屬山羊痘病毒（goat?poxvirus，GTPV）引起的一種呈地方流行的高度接觸性傳染病，一年四季均可發生，春秋常見，不分性別、年齡、品種。世界動物衛生組織（OIE）將山羊痘列為A類重大傳染病，1999年中華人民共和國農業部第96號公告將山羊痘列為國家一類動物疫病。近年來，我國二十多個省市相繼報導山羊痘發生流行，給我國蓬勃興起的山羊養殖業造成了極大的經濟損失，帶來了嚴峻威脅。傳統的檢測山羊痘的方法可采用瓊脂擴散法，但該方法的靈敏度不高、檢測速度較慢。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有檢測山羊痘疾病的方法的靈敏度不高、檢測速度較慢的缺陷，提供一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑及其制備方法，該試劑可敏感、快速、準確、簡便的檢測山羊痘病毒抗原。

為了解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案：

????本發明山羊痘反向間接血凝診斷試劑中山羊痘IgG致致敏紅細胞的含量為0.8～1%（體積），純化山羊痘IgG含量為1.549mg/ml。

上述山羊痘反向間接血凝診斷試劑中的致敏紅細胞是用純化山羊痘IgG致敏的醛化綿羊紅細胞。

本發明還提供了一種制備前述山羊痘反向間接血凝診斷試劑的方法：采集健康綿羊靜脈血，制備成紅細胞懸液，用戊二醛和鞣酸進行醛化，在醋酸鹽緩沖液中用純化山羊痘IgG致敏，離心分離，取沉淀紅細胞配制成紅細胞懸液，經血凝檢測合格后即得。

進一步的，上述方法為：采集健康綿羊靜脈血，用PBS離心分離提取紅細胞，再用磷酸緩沖液制備成紅細胞懸液，用戊二醛醛化后重新用磷酸緩沖液配制成紅細胞懸液，然后再用鞣酸醛化，離心分離得醛化紅細胞，將醛化紅細胞在醋酸鹽緩沖液中用純化山羊痘IgG致敏，離心分離，取沉淀紅細胞用含NaN₃和新生小牛血清的磷酸緩沖液洗滌，再用此緩沖液配制成紅細胞懸液，經血凝檢測合格后即得。

最佳的，前述制備方法為：采集健康綿羊靜脈血，用PBS離心分離提取紅細胞，再用0.1M、pH7.4的磷酸緩沖液制備成體積百分比為2.5%的紅細胞懸液，用戊二醛醛化后重新用0.1M、pH7.4的磷酸緩沖液配制成體積百分比為2.5%的紅細胞懸液，然后再用新鮮鞣酸在37℃的水浴鍋中醛化l小時，用0.1M、pH7.4的磷酸緩沖液的洗滌，離心分離得醛化紅細胞，將醛化紅細胞加入10體積倍量的0.1M、?pH?3～4的醋酸鹽緩沖液中，再與等體積量純化山羊痘IgG稀釋液混合，置于37℃感作2h致敏，離心分離，取沉淀紅細胞用含0.1%（重量）NaN₃和1%（體積）新生小牛血清的0.1M、pH7.4磷酸緩沖液洗滌，再用此緩沖液配制成紅細胞懸液，經血凝檢測合格后即得。

采用前述診斷試劑檢測山羊痘的方法：檢測時，pH值控制在7.4～7.8，反應溫度20～25℃，反應時間50min。

與現有常用的瓊脂擴散實驗相比，本發明以純化山羊痘IgG致敏醛化綿羊紅細胞制備了山羊痘反向間接血凝診斷試劑，可快速、準確、簡便的檢測山羊痘病毒抗原，具有較好的特異性、敏感性和可重復性，可廣泛應用于獸醫臨床上山羊痘病毒抗原的快速檢測，為疾病預防、診斷和防控提供依據。

具體實施方式

山羊痘反向間接血凝診斷試劑按如下配比和方法制備

1、制備醛化紅細胞

無菌采集健康綿羊靜脈血，加10體積倍PBS，2000轉/分離心15分鐘，用PBS洗5遍，以磷酸緩沖液（0.1M，pH?7.4）配成2.5%（體積百分比）的紅細胞懸液，然后將此紅細胞懸液與1%（體積百分比）戊二醛水溶液以9：1的體積比混合，于室溫下緩慢攪拌1h，2000?轉/分離心15分鐘，用磷酸緩沖液洗5遍，重新制成2.5％的懸浮液，然后將該懸浮液與等體積量1/200000（體積比）新鮮鞣酸溶液混合，置37℃的水浴鍋中l小時后取出，用磷酸緩沖液洗滌3次，2000轉/分離心15分鐘得醛化沉淀紅細胞。

2、致敏：將醛化沉淀紅細胞加入10體積倍量醋酸鹽緩沖液(0.1M,?pH?3～4)中，再與等體積量純化山羊痘IgG稀釋液(1.549mg／ml)混合，置于37℃感作2h，其間每隔15min吹吸混勻1次，2000轉/分離心15分鐘，得沉淀致敏紅細胞。