[發(fā)明專利]含有番茄LeEXP2基因的重組載體及重組菌及LeEXP2基因在重組菌中的表達(dá)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110161314.6
• 申請(qǐng)日: 2011-06-16
• 公開（公告）號(hào): CN102286520A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬媛媛;鄒少蘭;張?chǎng)H;洪解放;井欣;張敏華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;C12N15/29;C07K14/415;C12R1/84
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種含有番茄LeEXP2基因的重組載體，其特征是用下述方法構(gòu)建：

(1)提取番茄的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，用序列表中SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列為上、下游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出序列表中SEQ?ID?NO.3所示的744bp的LeEXP2基因，連接至TA載體pGEM-T，獲得含有番茄LeEXP2基因的質(zhì)粒pGEM-LeEXP2；

(2)LeEXP2基因構(gòu)建至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體：以所述質(zhì)粒pGEM-LeEXP2為模板，以序列表中SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5所示核苷酸序列為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得序列表中SEQ?ID?NO.6所示的703bp片段，將所述703bp片段經(jīng)TA克隆連至pGEM-T載體，命名為pTLeEXP2；提取質(zhì)粒pTLeEXP2和巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPICZalpha?A質(zhì)粒，用EcoRI和XbaI同時(shí)酶切pTLeEXP2和pPICZalpha?A，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切pTLeEXP2得到SEQ?ID?NO.7所示的689bp片段和酶切pPICZalpha?A得到的SEQ?ID?NO.8所示的3530bp片段；回收產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F′的感受態(tài)細(xì)胞中，涂含Zeocin?25μg/mL的LB平板，培養(yǎng)12-16h，得到含pPICZalpha?A-LeEXP2質(zhì)粒的大腸桿菌，提取大腸桿菌中pPICZalpha?A-LeEXP2質(zhì)粒，即得到含有番茄LeEXP2基因的重組載體。

2.一種含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌，其特征是用下述方法獲得：

將10-15μg的權(quán)利要求1所述pPICZalpha?A-LeEXP2質(zhì)粒，用PmeI酶切成SEQ?IDNO.9所示的4219bp片段，乙醇沉淀SEQ?ID?NO.9所示的線性DNA片段，干燥所述線形DNA片段后溶于無菌水，制成濃度為0.5-1μg/μL的線形DNA溶液；將80μL巴斯德畢赤酵母宿主菌X33的感受態(tài)細(xì)胞與10μL的0.5-1μg/μL的線形DNA溶液混合勻后轉(zhuǎn)移到0-4℃預(yù)冷的電極杯中，冰浴5min，1500V電擊5ms，電擊后加入1mL冰冷的1M山梨醇水溶液到電轉(zhuǎn)杯中，混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，28-30℃靜置培養(yǎng)1-2h，在含100μg/mLZeocin的YPD平板上涂50μL-200μL培養(yǎng)后的混合液，30℃倒置培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，PCR鑒定菌落，PCR結(jié)果為陽性的菌落為含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichia?pastoris)，其中的重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichia?pastoris)L15CGMCC?NO.4123為保藏菌種。

3.番茄LeEXP2基因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的誘導(dǎo)表達(dá)，其特征是包括下述步驟：

①將權(quán)利要求2所述含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌和巴斯德畢赤酵母宿主菌X33分別接種在2-3ml?pH＝4.8的BMGY中預(yù)培養(yǎng)，200-250轉(zhuǎn)/分鐘，28-30℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝2-6；

②按1∶100的體積比分別將步驟①的經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至25ml?BMGY培養(yǎng)基中，200-250轉(zhuǎn)/分鐘，28-30℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝2-6；

③將步驟②培養(yǎng)的菌液分別轉(zhuǎn)接加入至50ml?pH＝4.8的含體積濃度為0.5％-1％甲醇的BMMY培養(yǎng)基中，使菌液的濃度OD₆₀₀＝0.8-1.5；在200-250轉(zhuǎn)/分鐘，28-30℃搖床中培養(yǎng)，每24h補(bǔ)甲醇至0.5％-1％，誘導(dǎo)LeEXP2基因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的表達(dá)。