[發明專利]抗IMMT全人源Fab抗體及其在制備抗肝癌藥物中的應用

無效

• 申請號: 201110150563.5
• 申請日: 2011-06-07
• 公開（公告）號: CN102229671A
• 公開（公告）日: 2011-11-02
• 發明（設計）人: 任勇亞;杜麗堅;任政;張曉;李紅;馮振卿
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;A61K39/395;A61P35/00;A61P1/16
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種抗IMMT全人源Fab抗體及其在制備抗肝癌細胞HepG2藥物中應用。

背景技術

原發性肝癌是危害人類健康的重要疾病之一，多次被我國政府列為研究和防治的重點。肝癌的治療長期以來一直是一個世界性的難題。肝癌發病隱匿，患者就診時多屬中、晚期，而且肝癌是一種惡性程度高、浸潤和轉移性強以及先天性耐藥的惡性腫瘤，手術、放療、化療及介入等常規治療療效均不理想，也不能從根本上解決肝癌的轉移和復發，特別是面對那些分化程度低或未分化、已經遠處轉移、病期較晚的肝癌患者可謂束手無策。此外抗癌藥物的普通制劑給藥后在全身分布，殺傷癌細胞的同時也損傷正常細胞，產生嚴重的不良反應。因此研發特異性強、靶向性強、療效高、副作用小的藥物成為一項關系到人民生命健康的重要工程，已成為腫瘤領域的研究熱點。

南京醫科大學衛生部抗體技術重點實驗室承擔衛生部科學研究基金課題“肝癌早期相關基因和腫瘤標志物篩選”的研究課題期間，使用經典方法二乙基亞硝胺誘導Wistar大鼠成功建立肝癌模型，分別把不同時期(非特異性肝損傷、肝硬化、肝細胞不典型增生、早期肝癌結節和肝癌晚期出現遠處轉移灶)的肝臟組織提取RNA，進行Affymetrix芯片檢測(GeneChip?Rat?Genome?2302.0Array)。分析發現線粒體內膜蛋白IMMT(Inner?Membrane?Protein，Mitochondrial)在大鼠肝癌呈高水平表達，是正常組織的2⁵倍，而在非特異損傷和硬化階段表達卻沒有檢測到表達升高，并經過熒光定量PCR技術和綠色熒光蛋白示蹤技術所證實。大鼠肝癌發生與人體肝癌發生的過程非常相似，而大鼠IMMT與人體的IMMT高度同源(100％)。本實驗室已經在臨床原發性肝癌組織標本和相應的非肝癌肝組織標本中通過熒光實時定量PCR比較發現，IMMT表達水平在肝癌組織中高于非肝癌肝組織，IMMT可能通過影響肝癌細胞內骨架蛋白的構像和分布，從而改變肝癌細胞的運動能力，參與肝癌侵襲機制。IMMT高表達的肝癌細胞獲得淋巴細胞的“偽裝”，逃避人體免疫系統的識別和殺傷，更易進入淋巴結，形成轉移。因此IMMT成為肝癌靶向治療的一個良好的靶點。通過在美國Pubmed和中國CNKI數據庫的檢索，目前尚未見相關研究報道。目前抗肝癌IMMT鼠源單克隆抗體在本實驗室已研制成功。用于肝癌治療的人源抗IMMT基因工程抗體，目前國內外均無報道。

發明內容

技術問題：本發明旨在提供抗IMMT?Fab抗體重、輕鏈可變區基因及其編碼的多肽，以及該抗體在制備抗肝癌藥物中的應用。

技術方案：抗IMMT全人源Fab抗體，輕鏈的氨基酸序列如SEQ?ID?No：1所示，重鏈的氨基酸序列如SEQ?ID?No：2所示。

抗IMMT全人源Fab抗體，輕鏈的核苷酸序列如SEQ?ID?No：3所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ?ID?No：4所示。

所述的抗IMMT全人源Fab抗體在制備抗肝癌藥物中的應用。

本發明人從原發性肝癌患者全血中分離的B淋巴細胞中克隆了基因組所有的抗體重、輕鏈可變區基因，采取基因工程方法，構建庫容量為1.3×10⁹的全人源免疫型Fab抗體庫。用純化的IMMT蛋白對噬菌體抗體庫進行富集篩選，分離了1株抗IMMT型的特異性人源Fab抗體。測序結果證實其Fd鏈和L鏈的DNA序列及氨基酸序列(命名為hFabr1)。對克隆可溶性表達后的沉淀及上清進行SDS-PAGE和Western?blot分析，證實在約26kD和30kD左右有二條目的條帶，確定抗體有可溶性表達。ELISA顯示克隆與IMMT蛋白反應陽性(OD_450nm＝1.218)，說明該克隆是與IMMT有特異性結合活性的Fab抗體片段。

有益效果：體外觀察hFabr1抗肝癌效應結果表明，hFabr1能抑制HepG2細胞的增殖和侵襲，誘導HepG2細胞凋亡。動物體內實驗表明hFabr1能明顯抑制荷瘤裸鼠體內HepG2移植瘤的生長。全人源抗IMMT基因工程抗體的獲得不僅為原發性肝癌的預防和治療帶來了希望，也為研制能用于肝癌和其它惡性腫瘤生物治療的抗體藥物提供了新的思路和技術貯備。

附圖說明