[發明專利]利用減毒傷寒沙門菌遞送的HBV-熱休克蛋白70融合基因疫苗及制法和應用

無效

• 申請號: 201110149193.3
• 申請日: 2011-06-03
• 公開（公告）號: CN102805872A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 貌盼勇;劉澤;辛紹杰;胡燕;白冰珂;沈宏輝;高蓉;侯俊;王志杰;羅聲棟;柴艷濤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫院;北京綠竹生物制藥有限公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/29;C12N15/31;C12N15/51;C12N15/52;C12N15/79;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 劉徐紅

技術領域

本發明涉及一種利用減毒傷寒沙門菌遞送的HBV突變型preC/C基因疫苗和一種HBV-熱休克蛋白70融合基因疫苗及其制備方法和應用，具體為利用減毒傷寒沙門菌遞送的一種HBV突變型preC/C基因疫苗、一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗和一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細胞表位融合基因疫苗及其制備方法和應用，屬于乙肝疫苗的設計制造及免疫效果檢測的生物學領域。?

背景技術

慢性乙型肝炎嚴重危害人類健康，目前尚無特效治療手段。乙肝病毒(HBV)感染人體后發生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特異性細胞免疫應答，不能清除體內病毒。由于DNA疫苗在誘導機體特異性細胞免疫方面具有獨特優勢，已作為針對慢性乙肝具有潛力的免疫治療手段被廣泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦點在于：(1)如何誘導足夠強的特異性細胞免疫，以達到抑制或消滅病毒、治療乙肝的目的；(2)改良接種方式，易于為患者接受。?

使用分枝桿菌熱休克蛋白70羧基端(HSP70c)或T細胞刺激表位(HSP70t)基因構建融合基因疫苗可以起到佐劑的作用，同時減少機體針對HSP70的免疫應答。利用攜帶DNA質粒的減毒傷寒沙門菌口服，可直接將DNA質粒遞送至抗原呈提細胞，極大提高DNA疫苗的利用率，同時口服的免疫方式安全方便，易于為患者接受。?

本發明針對熱休克蛋白融合基因疫苗和利用減毒傷寒沙門菌遞送DNA疫苗的諸多特性和優點，采用現代分子生物學技術和手段對其進行了進一步的研究和改進。?

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種以HBV突變型preC/C基因為目的基因構建的重組HBV?DNA疫苗(VC)、一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因為目的基因構建的重組HBV?DNA疫苗(VCC)和一種以HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細胞表位融合基因為目的基因構建的重組HBV?DNA疫苗(VCT)。?

本發明的第二個目的在于提供一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門菌(SVC)、一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門菌(SVCC)和一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門菌(SVCT)。首先將目的基因使用真核表達載體，構建質粒，然后采用電轉化的方法，轉化減毒傷寒沙門菌SL7207，得到攜帶目的基因的重組減毒傷寒沙門菌。?

本發明的第三個目的在于提供一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門菌、一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門菌和一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門菌用于乙型肝炎的預防和治療。該重組減毒傷寒沙門菌能有效誘導特異性體液免疫和細胞免疫，可用于乙型肝炎的預防和治療。?

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：?

一種HBV突變型preC/C基因疫苗(VC)，其包括HBV突變型preC/C基因(簡稱preC/C)，該目的基因的真核細胞表達載體為VR1012。所述的HBV突變型preC/C基因是HBVpreC/C基因經人工引入4個點突變，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。?

一種構建HBV突變型preC/C基因疫苗(VC)的方法，其步驟如下：首先以含有HBV突變型preC/C基因的質粒VEC4為模板，用PCR擴增出HBV突變型preC/C基因序列，無終止密碼子，連入T-Easy載體，再通過雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達載體VR1012，克隆篩選得到HBV突變型preC/C基因疫苗無終止密碼子質粒，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。?

一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因疫苗，其包括HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因，該目的基因的真核細胞表達載體為VR1012。?

所述的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因是HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因(簡稱preC/C-HSP70c)。即一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗(VCC)，其包括HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，該目的基因的真核細胞表達載體為VR1012。真核細胞表達載體VR1012上插入核苷酸序列的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因。?