[發明專利]高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株及其構建方法

無效

• 申請號: 201110141622.2
• 申請日: 2011-05-30
• 公開（公告）號: CN102226166A
• 公開（公告）日: 2011-10-26
• 發明（設計）人: 路福平;劉逸寒;張艷;王春霞;王建玲
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明是利用基因工程技術構建基因工程菌株，尤其是一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株及其構建方法。

背景技術

普魯蘭酶(Pullulanase，EC?3.2.1.41)是一種能夠專一性切開支鏈淀粉分支點中的α-1，6-糖苷鍵，從而剪下整個側枝，形成直鏈淀粉的解支酶，在改善淀粉酶對淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低糧耗、提高產品質量及開發新產品方面有相當巨大的價值，在淀粉加工工業中有著重要的用途及良好的市場前景，目前已經被成熟的應用于高麥芽糖漿、高葡萄糖漿及干啤酒的生產中。

目前，普魯蘭酶的產量很低，只有丹麥諾維信及美國杰能科工業化生產并銷售此酶，國內企業均依賴進口，價格昂貴。普魯蘭酶工業化生產菌株較少，我國關于普魯蘭酶的研究主要集中在產普魯蘭酶菌株的篩選、誘變及優化等方面，效果均不太理想，而隨著基因工程技術的發展，利用基因工程技術改造菌種，進一步提高酶的產量及活性，降低生產成本成為可能，并在世界范圍內得到越來越廣泛的重視及應用。近幾年，我國學者特別是江南大學學者利用基因工程技術構建基因工程菌株取得了一定的效果：2006年，夏子芳利用大腸桿菌表達系統表達海棲熱袍菌普魯蘭酶基因，并得到少量酶活；2008年，張明焱將來源于Bacillus?licheniformis的普魯蘭酶編碼基因利用大腸桿菌表達系統表達，酶活力達5.6U/ml；2010年，王淑軍等人利用深海古菌Thermococcus?siculi?HJ21?PCR擴增出一新的普魯蘭酶編碼基因，并在大腸桿菌中得到表達，但表達量較低。

我國關于普魯蘭酶的研究起步較晚，為了改變對進口產品的依賴，尋求一條國產化的道路，本發明利用基因工程技術構建基因工程菌株，進一步提高酶的產量及活性，為其工業化生產奠定基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株及其構建方法，通過重新構建后獲得基因工程菌的普魯蘭酶的表達量明顯提高，為其工業化生產奠定基礎。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株含有普魯蘭酶基因，普魯蘭酶基因基因的來源是Bacillus?naganoensis(ATCC53909)。

而且，所述基因工程菌株的宿主菌是大腸桿菌BL21(DE3)。

而且，所述基因工程菌株的普魯蘭酶基因由Bacillus?naganoensis(ATCC53909)染色體DNA擴增得到的。

一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株的構建方法，方法的步驟如下：

(1)基因克隆：根據NCBI上報道的基因序列設計引物，以Bacillus?naganoensis(ATCC53909)菌株的染色體DNA為模板克隆得到普魯蘭酶基因；

(2)基因工程菌株的構建：將所獲得的普魯蘭酶基因與載體pEY-22b(+)連接，酶切驗證；

(3)將酶切驗證正確的載體轉化到宿主E.coli?BL21(DE3)內，之后進行酶切，測序驗證，確定構建含有普魯蘭酶基因的基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul。

而且，基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul經發酵所測粗酶液酶活力為10.94U/mg，比出發菌株Bacillus?naganoensis(ATCC53909)酶活力提高了37倍。

本發明的優點和積極效果如下：

本發明首次利用基因工程技術構建了含有普魯蘭酶基因的工程菌株，本菌株經誘導后獲得的粗酶液的酶活力達10.94U/mg，比出發菌株酶活力提高了37倍，實現普魯蘭酶的高效表達，為普魯蘭酶在食品工業中的應用及工業化生產奠定基礎。

附圖說明

圖1為本發明的PCR擴增圖，其中：1為PCR產物；2為1kb?DNA?marker；

圖2為本發明重組質粒的構建流程；

圖3為本發明酶切驗證凝膠圖，其中：1為1kb?DNA?marker；2為經BamH?I和Sal?I雙酶切；3為經BamH?I單酶切；4為經BamH?I單酶切的pET-22b(+)；

圖4為本發明蛋白電泳圖，其中1為BL21(DE3)/pET22b-pul誘導前的全細胞；2為BL21(DE3)/pET22b-pul誘導后的全細胞；3為BL21(DE3)誘導前的全細胞；4為BL21(DE3)誘導后的全細胞；5為BL21(DE3)/pET-22b(+)誘導前的全細胞；6為BL21(DE3)/pET-22b(+)誘導后的全細胞；M為蛋白marker。

具體實施方式