[發明專利]一組引物及其在家蠶微孢子蟲的快速檢測方面的應用

有效

• 申請號: 201110141178.4
• 申請日: 2011-05-30
• 公開（公告）號: CN102260737A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 劉吉平;魏建影
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

1.一組應用于樣本微孢子蟲快速檢測的引物，其特征在于包括引物F2和B2、FI2和BI2，分別具有SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2?、SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列。

2.一種權利要求1所述引物的應用，其特征在于應用于制備LAMP法檢測家蠶樣本微孢子蟲用的試劑。

3.根據權利要求2所述引物的應用，其特征在于所述LAMP法檢測家蠶樣本微孢子蟲的方法包括以下步驟：

（1）采用煮沸沉淀法抽提待測樣本的模板DNA；

（2）以登錄號為D14632的擬假基因rDNA序列為靶基因，采用具有SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2?、SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列的引物，對步驟（1）制備的樣本模板DNA進行LAMP反應；

（3）將步驟（2）所述LAMP反應產物中加入1μL?10000×SYBR?Green?I染色檢測。

4.根據權利要求3所述引物的應用，其特征在于步驟（1）抽提樣本模板DNA包括以下步驟：

（a）取家蠶樣本的中腸于研缽中，液氮研磨后，取200μL研磨液于無菌的1.5?mL離心管中；12000?r/min，離心5?min，棄上清，得孢子沉淀備用；

（b）加100μL?DNA裂解液于步驟（a）制得的孢子沉淀中，混勻后，煮沸10～15?min；

所述DNA裂解液：取9?mL?1M?Tris-HCl（pH?8.0）、1.8?mL?0.5M?EDTA、18?mL?5M?KCl和90?mL?1%?Triton?X-100混勻后，用ddH₂O定容至900?mL；

（c）將步驟（b）煮沸后的混合液在12000?r/min條件下離心，取上清，即為模板DNA溶液，置-20℃冰箱保存備用。

5.根據權利要求4所述引物的應用，其特征在于步驟（b）所述DNA裂解液在與孢子沉淀混合之前先置于110?℃電熱鼓風干燥箱中孵育10～15?min。

6.根據權利要求3所述引物的應用，其特征在于步驟（2）所述LAMP反應采用25?μL反應體系，所述反應體系為：2.5?μL?10×Thermopol?Buffer（20?mM?Tris-HCl，pH8.8；10?mM?KCl；2?mM?MgSO4；20?mM（NH4）₂SO₄；0.1%?Triton?X-100；）；2.8?mM?dNTPs；1M甜菜堿；6?μL?25mMMgCl2；40?pmol?FI2/BI2、5?pmol?F2/B2；2?μL?Template?DNA；1?μL?Bst?DNA?polymerase（8U）；ddH2O補至25?μL；所述反應條件為：63℃水浴60?min；最后95℃，2?min滅活。