[發明專利]RANKL-TNF樣區融合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110135019.3
• 申請日: 2011-05-24
• 公開（公告）號: CN102241776A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 袁慧慧;趙文明;余丹
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/00;A61P19/02;A61P19/04;A61P29/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種RANKL-TNF樣區融合蛋白，本發明還涉及該融合蛋白的制備方法以及在類風濕關節炎治療性疫苗中的用途。

技術背景

類風濕關節炎(rheumatoid?arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫病，以破壞性關節炎為特征，病變特點為侵蝕性滑膜炎，以及由此造成的關節軟骨和骨質破壞，最終導致關節畸形而致殘。由于RA的患病率高、致殘率高、病因尚未完全闡明，特別是RA給社會經濟、勞動力造成了嚴重損失，因此，對RA治療的研究具有重要的醫學和社會經濟意義。而RA又是一種難治性疾病，雖然現有治療手段多種多樣，但都不甚理想。本發明針對RA發病中骨破壞及慢性炎癥反應這兩個相關聯的RA關鍵性病理學問題，研制RANKL-TNF樣區融合蛋白，為RA的治療開辟了一種新的思路。

RANKL是腫瘤壞死因子超家族(tumor?necrosis?factor?superfamily，TNFSF)的成員，基因位于人13號染色體13q14，全長316個氨基酸，分子量大小為35～45kD，分三個亞型：RANKL₁和RANKL₂為跨膜型三聚體(trimeric?transmembrane?form)，RANKL₃為可溶型單體(solublemonomer)，兩種類型均可與誘餌受體骨保護素(osteoprotegerin，OPG)結合而失去生物活性，人鼠同源性為77％。RANKL為I型跨膜蛋白，由胞內、胞外和跨膜段組成，核心結構為胞外羧基端的158個氨基酸，由數條β型折疊構成，為TNF家族同源性結構域。RANKL主要分布在免疫系統、骨骼系統和循環系統。參與骨破壞的RANKL主要由成骨/骨髓基質細胞、活化的T細胞、關節滑膜細胞和單核巨噬細胞分泌，通過自分泌和旁分泌方式與受體RANK結合發揮作用。RANKL的表達受到多種細胞因子的調控，如骨吸收因子、糖皮質激素、1α，25(OH)₂-VD₃、IL-1、IL-6、IL-11、TNF-α、PGE₂和PTH等，這些因子都可誘導成骨細胞表達RANKL，從而促進骨吸收。RANKL的發現使我們對破骨細胞(osteoclast，OC)分化、活化、增殖有了更進一步的認識。RANKL的受體RANK(receptor?activatorof?nuclear?factor)是腫瘤壞死因子受體超家族(tumor?necrosis?factor?receptorsuperfamily，TNFRSF)成員，基因定位于18q22.1，是616個氨基酸的肽段，屬I型跨膜蛋白，有一個短的含有21個氨基酸的穿細胞膜基團和一個383個氨基酸殘基的細胞內羧基末端，人鼠同源性為60％。主要表達在單核巨噬細胞系統，包括破骨細胞及前體細胞、淋巴細胞、內皮細胞、成纖維細胞。RANKL在RA患者關節腔表達量增加并與破骨細胞及其前體細胞表面的RANK結合，RANK胞內域構象改變與其銜接蛋白腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF?receptor-associated?factor?6，TRAF6)結合后使其活化；活化的TRAF6作為一個多功能的第二信使(second?messager)使轉錄因子NF-κB或分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated?protein?kinase，MAPK)激活，其中MAPK又包含了應激活化蛋白激酶(c-Jun?N-terminalkinases/stress-activated?protein?kinase，JNK)和胞外信號調節激酶(extracellular?signal-regulated?kinases，ERK)兩條途徑。JNK能進一步激活c-Jun和活化蛋白1(AP-1)，影響破骨細胞和T細胞核內因子的活性。ERK是c-Fos表達與否的調控因子，后者是破骨細胞分化中一個重要的轉錄因子。NF-κB作為一個二聚體轉錄因子，激活后由胞漿進入胞核識別DNA序列的κB位點；鈣信號啟動核因子活化的T細胞c1(nuclear?factor?ofactivated?T?cell?c1，NFATc1)并與啟動子區結合，使破骨細胞分化相關基因轉錄表達，破骨前體細胞增殖、分化、成熟為有功能的破骨細胞，使骨吸收增加。同時，破骨細胞表面也存在RANK，與RANKL結合后使破骨功能增強。與此同時，表達在活化的T細胞上的RANKL與自身或DC上RANK結合，能激活免疫系統。體外實驗證明，T細胞產生的RANKL能直接啟動破骨細胞的增殖；ctla4^-/-基因敲除鼠能抑制活化T細胞對骨密度的破壞。免疫系統與骨系統之間的惡性循環是RA骨破壞持續存在的原因。