[發明專利]一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法

無效

• 申請號: 201110124912.6
• 申請日: 2011-05-16
• 公開（公告）號: CN102241791A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 夏海鋒;金雄華;吳璞強;饒志明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C08B37/12
• 分類號: C08B37/12;B01J20/291;B01D15/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法，屬于層析分離中基質材料的修飾方法。

背景技術

層析技術是一種最有效、最普遍采用的生物分離技術和方法之一，層析技術的關鍵就是層析介質。瓊脂糖凝膠具有良好的親水性、化學可修飾性而作為層析介質的基質材料應用于各種生物大分子的分離純化；其表面必須進行修飾，通過對其表面羥基的活化并偶聯配基，進而衍生出各種層析介質。常見的羥基活化方法有溴化氰(CNBr)、環氧氯丙烷、高碘酸鈉(NaIO₄)、二乙烯基亞砜，1，4-丁二醇二縮水甘油醚(BDGE)等。

烯丙基縮水甘油醚的一端環氧基活性較高，易開環與瓊脂糖基質上的羥基反應，而另一端雙鍵則相對惰性，交聯或水解等副反應受到限制。與環氧氯丙烷、羰基二咪唑等常規的活化方法比較，烯丙基縮水甘油醚活化法具有活性高、副反應少的優點；相對于溴化氰法其活化過程也較安全。這種高效安全的活化方法為瓊脂糖凝膠色譜介質的高密度配基偶聯提供了可能。

末端含有N-羥基丁二酰亞胺基團(NHS)的瓊脂糖凝膠可以共價結合含有伯胺基團的配基，對于制備免疫親和介質來說經常是首選。相對于其他活化基團，末端含有NHS基團的瓊脂糖與配基偶聯時速度快、效率高，在介質的儲存和層析過程中很少會發生配基泄露。并且，使用NHS-瓊脂糖凝膠可以形成酰胺鍵，在pH為13的條件下仍能很穩定，適用于在純化過程中需要較高pH條件的操作。

因此，本發明采用烯丙基縮水甘油醚對國產交聯瓊脂糖凝膠進行活化，加成巰基乙酸后，偶聯N-羥基丁二酰亞胺，得到一種連接臂長度為10個原子、具有對氨基高度特異性的瓊脂糖凝膠。通過控制瓊脂糖凝膠活化雙鍵的量，可使N-羥基丁二酰亞胺的修飾密度處在一個較寬的范圍(20-150μmol/mL)，這將有效減少介質上雜基團的引入并有利于配基密度的設計。上述活化過程對介質的性能沒有明顯影響。活化介質在30min內即可完成對L-苯丙氨酸的偶聯，效率在90％以上，且配基在貯藏過程中穩定性好、幾乎無泄露。

發明內容

本發明的目的是提供一種瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法。

所述的瓊脂糖凝膠的N-羥基丁二酰亞胺修飾方法的步驟是：

1)烯丙基縮水甘油醚活化

將10mL瓊脂糖凝膠水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用5倍體積30％、70％丙酮洗滌，最后用5倍體積的100％二氧六環洗滌5次、抽干，轉移到100mL具塞三角瓶中，加入10mL二氧六環、0.05-2mL烯丙基縮水甘油醚和50-300μL的三氟化硼乙醚，35℃下140rpm水浴搖床中反應45min，反應后的基質依次用5倍體積30％、70％丙酮洗滌，最后用大量去離子水洗滌干凈；

2)雙鍵加成巰基乙酸

取10mL活化基質，加入1.20mL巰基乙酸、10mL去離子水、0.25g過硫酸銨，60℃下反應8h；

3)N-羥基丁二酰亞胺基團的偶聯

取10mL巰基乙酸羧化后的瓊脂糖凝膠，分別用30％、70％和100％的丙酮溶液清洗，再用100％二氧六環清洗5次；將二氧六環替換后的瓊脂糖凝膠轉移到100mL帶塞三角瓶中，加入10mL二氧六環、0.2-1gN-羥基丁二酰亞胺、0.2-1gN，N，-二環己基碳二亞胺，25℃振蕩8-12h；最后用大量二氧六環、甲醇、丙酮清洗介質，于異丙醇溶液中避光貯存備用。

本發明采用烯丙基縮水甘油醚對交聯瓊脂糖凝膠進行活化，加成巰基乙酸后，偶聯N-羥基丁二酰亞胺。本發明的優點在于：烯丙基縮水甘油醚的活化效率高，活化密度范圍廣；瓊脂糖末端的N-羥基丁二酰亞胺對氨基特異性高，偶聯配基后穩定性好；制備工藝簡單，易于控制和放大；成本低廉，環境污染小。

附圖說明

圖1是本發明的工藝流程。

圖2是本發明修飾后瓊脂糖凝膠對L-苯丙氨酸的偶聯性能。實驗條件：25℃，150μmol雙鍵/mL-濕膠。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明作進一步的描述：

1、N-羥基丁二酰亞胺修飾

實施例1