[發明專利]一種通過無性繁殖建立齒肋赤蘚單株克隆體系的方法

有效

• 申請號: 201110116117.2
• 申請日: 2011-05-06
• 公開（公告）號: CN102257955A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 張丙昌;王敬竹;張元明
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆生態與地理研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H11/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發明領域

本發明涉及荒漠苔蘚單株克隆的生物技術領域，具體的說，本發明涉及一種齒肋赤蘚的單株克隆生物技術領域。

背景技術

近年來，我國荒漠化越來越嚴重，是世界上沙漠化最嚴重的國家之一，沙漠化土地總面積已達373萬平方公里，年擴展率為2460平方公里，每年因沙漠化造成的直接經濟損失高達540億元。針對這嚴重的現狀，尋求有效的途徑防止土地資源沙化已是當務之急。

傳統的防風固沙措施如植樹造林、草方格沙障和粘土沙障表面上看是有效的，但不能從根本上解決沙化和沙漠化土地的治理問題。主要是高等植物生長緩慢，生長周期長，另外，每棵高等植物都相當于一個大型的抽水泵，將地下水通過蒸騰釋放到大氣中，從而使本已貧乏的地下水更加貧乏。特別是大于100cm較深層的土壤的含水量下降明顯，深根系固沙植物對根際區域水分的利用，進一步惡化了固沙區土壤深層的水分狀況，進而抑制了這些植物的生長和生存。

生物結皮作為干旱荒漠地區特殊環境的產物，是由苔蘚植物、細菌、真菌、藍綠藻、地衣與土壤形成的有機復合體。而土壤微生物結皮是苔類、葉苔、藍綠藻、地衣類、真菌和細菌等生物組分與其下很薄的土壤共同形成的一個復合的生物土壤層。生物結皮在其發育過程中，積極參與土壤的形成，具有改變土壤理化性質、增加土壤有機質含量的功能，對土壤抗侵蝕性能的提高有著顯著功效。土壤生物結皮抗逆性強，具有光合、生物固氮兩大生理功能，光能利用率遠高于高等植物，能夠有效的利用光能資源，可以在干旱、嚴寒、鹽堿、土壤貧瘠的惡劣的環境下發育生長，形成5-50mm厚的地表覆蓋物，從而增強地表的穩定性，有效地減小荒漠地表的侵蝕，在防風、固沙、防止土壤侵蝕、改變水分分布狀況等方面起著重要作用。

苔蘚植物是一類由水生生活轉為陸地生活過渡型的植物類群，在不同的生態系統中均有苔蘚植物的足跡。在荒漠生態系統中，苔蘚也占據著重要的生態位。齒肋赤蘚是古爾班通古特沙漠蘚類結皮層中的優勢物種，此物種參與生物結皮的形成，在生物防沙、固沙和生態小環境的改善中發揮著不可替代的作用。

苔蘚植物個體小，種類不宜鑒定，如在古爾班通古特沙漠中齒肋赤蘚與墻蘚屬中的泛生墻蘚、泛生墻蘚無芒變種形態非常接近，在野外采樣時容易混淆，不同研究者野外取樣不盡相同，甚至不是同一個種，在生理、分子調控機理獲取的研究結果缺乏可比性。亟需實現齒肋赤蘚單株克隆技術能夠解決了這一難題，從而保證實驗中獲取材料的統一性。

發明內容

針對國內外未見報道有關齒肋赤蘚的單株克隆的技術現狀，由于齒肋赤蘚與墻蘚屬中的泛生墻蘚、泛生墻蘚無芒變種形態非常接近，在野外采樣時容易混淆，不同研究者野外取樣不盡相同，甚至不是同一個種；另外，同一物種也存在不同的基因型，在生理、分子調控機理獲取的研究結果缺乏可比性。本發明的目的在于提供一種齒肋赤蘚的單株克隆體系的方法，保證了實驗中獲取材料的統一性。

本發明具體提供一種通過無性繁殖建立齒肋赤蘚單株克隆體系的方法，具體培養步驟包括：

(1)在野外蘚類結皮中，選取生長良好的齒肋赤蘚純群，在實驗室內經形態鑒定確認是齒肋赤蘚后，再選取一株生長健壯的植株，通過無菌蒸餾水沖洗干凈、70％酒精消毒處理20s；

(2)配制經改良的BBM液體培養基，將pH調至8.0，添加瓊脂粉，添加量為15g·L^-1，混勻后121℃滅菌30min，然后將培養基倒入培養皿中；

(3)在接種過程中，通過超凈工作臺，用已滅菌的尖頭鑷子取已處理好的單株齒肋赤蘚再生能力強的莖尖和莖，接種在已滅菌的BBM固體培養基中，另外將莖葉碎片接在其它固體平板中，用parafilm封口膜將培養皿封口；

(4)將上述獲得的培養皿置于光照培養箱中，培養溫度25℃，光照強度36μmol·m^-2·s^-1，光照/黑暗時間為14h/10h，培養2-3周后，苔蘚莖尖和莖上的芽孢再生能力強，經光照誘導后開始長出新的分枝；在葉片基部形成愈傷組織后也會出現新的分枝；莖葉碎片會出現原絲體，原絲體發育到一定階段，出現新的分枝；2周后，將新的分枝取下，分別取其莖尖和莖再次轉接到新的固體培養基中，反復轉接，逐級擴大培養，形成單株克隆系。

本發明中，在制備BBM固體培養基瓊脂粉添加量為15g·L^-1，121℃滅菌30min，然后將培養基倒入直徑為90mm的培養皿中。