[發明專利]一種實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的方法

有效

• 申請號: 201110084977.2
• 申請日: 2011-04-06
• 公開（公告）號: CN102206709A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發明（設計）人: 羅寶正;薄清如;廖秀云;沙才華;徐海聶;王振全;陳軒;蘇惠龍
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭

技術領域

本發明涉及檢測技術領域，特別涉及一種可以精確、特異、快速檢測CSFV的方法。

背景技術

豬瘟(swine?fever，SF)，又稱豬霍亂(hog?cholera，HC)、爛腸瘟，在歐洲則被稱為古典豬瘟(classical?swine?fever，CSF)，是世界上養豬業的一種重要的傳染病，一度給養豬業帶來了嚴重的經濟損失。

對于CSF的傳統診斷方式主要有動物試驗、免疫熒光試驗、血清中和試驗、ELISA、單克隆抗體試驗。動物試驗是檢測豬瘟病毒的敏感方法，但是檢測時間較長且目前存在流行的豬瘟病毒大多為低毒力病毒株即使接種也不呈現出典型豬瘟癥狀；免疫熒光試驗方法較為特異，但是在實際檢測應用過程中此項技術要求具有熒光抗體、熒光顯微鏡以及檢驗者較高的檢測技術；血清中和試驗和ELISA試驗除檢測時間較長外，均難以鑒別疫苗抗體和感染后產生的抗體，很容易出現假陽性；單克隆抗體技術特異性較強，但是操作起來過程復雜，成本較高，不適應于大批量樣品診斷的要求。

因此，現有技術還有待于改進和發展。

發明內容

鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的方法，旨在解決現有技術中所存在的問題。

本發明的技術方案如下：

一種用于實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的特異性引物，其中，CSFV特異性引物序列如SEQ?NO.1-2所示。

一種用于實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的特異性探針，其中，CSFV特異性探針序列如SEQ?NO.3所示。

根據權利要求2所述的用于實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的特異性探針，其中，所述CSFV特異性探針的5′端標記發光基團FAM，3′端標記泯滅基團BHQ1。

一種使用上述的特異性引物和特異性探針的實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的方法，其中，包括以下步驟：

S100、樣品的預處理：對采集的樣品分別進行編號，在樣品中加適量青、鏈霉素雙抗溶液，?勻漿，取上清，4℃過夜；

S200、RNA提取：對采集的樣品提取RNA；

S300、CSFV的實時熒光定量RT-PCR反應：以上述步驟所提取的RNA為模板，加入CSFV的特異性引物和特異性探針，使用TAKARA公司的一步法RT-PCR試劑盒進行PCR擴增；S400、根據CSFV實時熒光定量RT-PCR反應結果，鑒定樣品中是否含有CSFV。

5、根據權利要求4所述的實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的方法，其特征在于，所述步驟S300中的實時熒光定量RT-PCR反應體系為25μL，每條特異性引物終濃度為0.2μmol/L，特異性探針濃度為0.1μmol/L；

反應條件為42℃30min，92℃2min，92℃10s，55℃30s，40個循環。

有益效果：本發明在ABI?7500?fast?real-time?PCR儀的基礎上建立了快速、靈敏、特異檢測CSFV的熒光RT-PCR方法。經過對本發明所建立的方法進行了特異性、靈敏度的驗證，結果顯示本方法可以較好的將CSFV同口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒和2型豬圓環病毒區分開，且靈敏度可以達到10拷貝數的數量級。另外，本發明所建立的方法整個反應過程是閉管操作，在最大程度上減少了體系的污染。本發明在診斷時間上同傳統方法相比自獲得待檢樣品到提取核酸，配制熒光定量RT-PCR反應體系，直到出現反應結果，整個過程可以在2.5h內完成，在保證檢驗結果的基礎上大大縮短了檢驗所需時間。

附圖說明

圖1是實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的靈敏度試驗結果曲線圖，從左到右的曲線的稀釋倍數依次是：10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10。

圖2是實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的特異性擴增熒光曲線。

圖3是本發明實施例1中實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV的結果圖。

具體實施方式

本發明提供一種實時熒光定量定量RT-PCR檢測CSFV的方法，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。