[發明專利]檢測諾氟沙星的scFv抗體、其編碼基因及應用

有效

• 申請號: 201110074363.6
• 申請日: 2011-03-25
• 公開（公告）號: CN102212136A
• 公開（公告）日: 2011-10-12
• 發明（設計）人: 鄭志明;侯曉林;金社勝;劉文娟;趙揚
• 申請（專利權）人: 商務部流通產業促進中心
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N15/13;C12N15/63;C12N7/01;G01N33/543;C12R1/92
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及免疫學檢測領域，具體地說，涉及一種檢測諾氟沙星的scFv重組抗體、其編碼基因及應用。

背景技術

諾氟沙星(Norfloxacin，NFLX)，化學名稱為1-乙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，是氟喹諾酮類抗菌藥，具廣譜抗菌作用，尤其對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高，對下列細菌在體外具良好抗菌作用：腸桿菌科的大部分細菌，包括枸椽酸桿菌屬、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌等腸桿菌屬、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、弧菌屬、耶爾森菌等。諾氟沙星體外對多重耐藥菌亦具抗菌活性。對青霉素耐藥的淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌亦有良好抗菌作用。諾氟沙星作為一種常用獸藥在畜牧業生產中得到廣泛使用。但因其具有一定的毒性，在動物性食品中的殘留對食品衛生和公共健康產生威脅。

檢測諾氟沙星殘留的方法主要有儀器分析法和免疫學方法。化學分析方法因需要昂貴的儀器設備、對樣品前處理要求高，且需要配備專門操作人員等，不適合現場監控檢測。免疫學方法，目前主要是Elisa(酶聯免疫吸附)方法，但該方法的核心試劑-單克隆抗體，因其制備和篩選過程繁瑣，且對操作技術要求很高，不利于廣泛應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測諾氟沙星的scFv抗體及編碼該抗體的基因序列及氨基酸序列。

本發明的另一目的是提供上述scFv抗體及其及其編碼基因在檢測諾氟沙星中的應用。

為了實現本發明目的，本發明人運用噬菌體展示技術，將小鼠抗體的重鏈、輕鏈可變區基因進行體外擴增，并借助了15肽的連接肽段將重鏈和輕鏈片段拼接成一條單鏈抗體scFv，接著將該scFv片段插入噬菌體展示載體pCANTAB5e中，構建成重組質粒，并轉化進宿主菌中，經過3輪固相淘篩和鑒定，獲得了抗諾氟沙星的scFv單鏈抗體。其包括重鏈和輕鏈，其中，重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ?IDNo.1和SEQ?ID?No.2所示。

前述的scFv抗體，重鏈和輕鏈之間的連接肽段為(Gly₄Ser)₃。

本發明還提供編碼上述scFv抗體的基因，其中，編碼scFv抗體重鏈的基因具有SEQ?ID?No.3所示的核苷酸序列，編碼scFv抗體輕鏈的基因具有SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列。

本發明還提供含有編碼上述scFv抗體的基因的載體。

本發明還提供含有上述載體的宿主細胞。

本發明進一步提供上述scFv抗體、編碼該抗體的基因、含有所述基因的載體或含有該載體的宿主細胞在檢測諾氟沙星中的應用。

本發明還提供上述scFv抗體的制備方法，其是將編碼上述scFv抗體的基因構建至表達載體中并轉化宿主細胞，然后進行蛋白的表達及分離純化。其中，所述表達載體為pCANTAB5e。

借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果：

本發明檢測諾氟沙星的scFv抗體，主要采用競爭性Elisa方法定性或定量檢測樣品中諾氟沙星的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品；采用高特異性的諾氟沙星scFv抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。本發明的方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測。能簡便、高效地運用本發明獲得的能分泌表達抗諾氟沙星重組抗體的重組菌株制備特異性的抗諾氟沙星scFv重組抗體。

附圖說明

圖1：scFv-pCANTAB5e重組質粒sfiI和NotI雙酶切電泳圖，M：DL2000核酸分子量Marker，1～10：scFv-pCANTAB5e酶切產物。

圖2：為30個重組菌誘導表達產生可溶性抗體scFv-ELISA檢測結果。

圖3：重組菌誘導表達產物SDS-PAGE電泳圖，1：重組菌誘導表達胞周間質，2：重組菌誘導表達上清液，3：陰性對照。

圖4：諾氟沙星誘導表達上清可溶性重組抗體IC₅₀實驗結果曲線圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

以下實施例中使用的試劑盒材料均為市售商品。

實施例1免疫原及檢測原的偶聯制備

1、材料