[發明專利]一種改進的免疫共沉淀技術方法

有效

• 申請號: 201110067054.6
• 申請日: 2011-03-21
• 公開（公告）號: CN102692505A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 趙曉航;許楊;劉芳;喬媛媛;馬首智
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院腫瘤研究所;中國人民解放軍海軍總醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

技術領域

本發明屬于免疫檢測領域，具體涉及一種優化的免疫共沉淀技術。本發明在原有的免疫共沉淀技術上，將免疫共沉淀技術與蛋白交聯技術結合起來。即利用蛋白交聯劑交聯抗原抗體復合物，經特異緩沖液洗脫，免疫印跡檢測顯著降低了實驗中抗體重鏈和輕鏈的污染，增加了方法的特異性。本發明提高了免疫共沉淀方法的特異性，具有穩定性和可重復性的特點，提高了實驗效率，為深入的進行分子生物學，分子腫瘤學、細胞生物學、生物化學等學科的研究提供了有益的幫助。

背景技術

隨著后基因組時代(post?genomie?era)的來臨，生物醫學研究已從一個基因一個蛋白的假說演繹到在組學水平分析眾多基因或蛋白的功能。由于細胞的各種生命活動現象紛繁復雜，全基因組的序列信息并不能詮釋細胞的生物功能。而基因的終極產物蛋白才是細胞構成及功能的最終執行者。每個蛋白并不是獨立的在細胞中完成所賦予的功能，在細胞復雜結構和高度有序的通路網絡中，通常與其它蛋白質相互作用形成大的復合物，而蛋白質與蛋白質之間的相互作用是蛋白質發揮生物功能的重要途徑。當前，科學家利用大規模的蛋白質組學技術發展并繪制了廣泛的細胞內蛋白質之間相互作用的網絡圖譜。迄今已發展了多種研究蛋白質相互作用的技術方法，包括酵母雙雜交系統、噬菌體展示技術、GST沉降試驗(GST?pull-down)技術、免疫共沉淀技術和串聯親和純化聯合質譜分析技術，為蛋白質相互作用及蛋白質組學的研究奠定了堅實的基礎。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，IP)是以抗體和抗原之間特異性結合為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典技術。主要利用非變性劑裂解完整細胞，維持了細胞內許多蛋白質間的相互作用，便于檢測蛋白質之間的相互作用。利用抗蛋白質A的抗體與A形成免疫復合物并沉淀，而細胞內與A穩定結合的蛋白質B同時被沉淀下來。蛋白質B的沉淀是基于與A的物理性相互作用，這種技術被稱為免疫共沉淀。該技術利用抗原抗體形成蛋白復合物沉淀，將蛋白質復合物溶解，再通過對抗體的親和層析將蛋白復合物分離純化出來，進而通過二維電泳。SDS-PAGE或質譜等技術鑒定分離得到的蛋白。其方法相對穩定、方法簡便并廣泛的應用于細胞生物學、分子生物學和蛋白質組學的科學研究中，免疫共沉淀技術是確定兩種蛋白質在細胞生理條件下相互作用的有效方法。

但這種經典的技術在實際的操作過程中存在不足，即SDS-PAGE鑒定分離純化的蛋白中，含有目的蛋白和抗體。由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇會導致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵破壞，從而使得抗體分子變成重鏈分子(55KD)和輕鏈分子(25KD)。因此，在免疫印跡顯色反應中，除了能檢測到目的蛋白外，還能檢測到重鏈和輕鏈分子。通常用于免疫沉淀的抗體量非常大(1μg)，所以當目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時，重鏈或者輕鏈分子的免疫印跡信號常常由于重鏈或者輕鏈信號過強而影響目的蛋白的檢測結果。

為了有效的避免實驗中重鏈和輕鏈對實驗造成的影響，很有必要對免疫共沉淀方法進行改進，來提供免疫共沉淀的特異性。

發明內容

為了實現這種改進，申請人對多種技術進行了比較和研究，最后發現將免疫共沉淀技術與蛋白交聯技術結合起來，即利用蛋白交聯劑交聯抗體與蛋白G(protein?G)形成的復合物，經特異緩沖液洗脫，免疫印跡檢測，能夠顯著降低實驗中抗體重鏈和輕鏈的污染，由此改進了免疫共沉淀的特異性。進而完成了本發明。

具體地，為了充分展示本發明的改進IP與傳統IP的不同之處，申請人針對本領域公知的蛋白結合，包括體凋亡誘導因子(AIF)與肌動蛋白(actin)受體相互作用蛋白(RIP3)與烯醇化酶(ENO1)進行了平行比較，結果發現本發明改進的IP實驗能夠顯著減輕重鏈和輕鏈污染，使免疫共沉淀的效果得到顯著改善，克服了以往技術中假陰性或者假陽性的結果。

進一步地，本發明提供了如下的改進的免疫共沉淀方法，其包括如下步驟：

(1)準備材料：

(a)提供含有蛋白X-Y結合的雙體復合物的待測樣品；

(b)提供抗蛋白X的抗體；

(c)提供固定在微珠上的蛋白G，其中所述固定是共價連接的固定；

(d)提供雙琥珀酰亞胺辛二酸酯(DSS)、甘氨酸和三羥甲基氨基甲烷試劑；

(2)將上述(b)的抗體和(c)的蛋白G接觸，在合適的條件下使固定在微珠上的蛋白G與抗X抗體的Fc片段物理性結合，得到微珠-蛋白G-抗X抗體的三體復合體，