[發明專利]一種多菌靈單克隆抗體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201110057555.6
• 申請日: 2011-03-10
• 公開（公告）號: CN102675463A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 王金花;曾靜;李小林;盧曉宇;韓深;張蓉;劉韋華;魏海燕
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 張文祎

技術領域

本發明涉及一種多菌靈單克隆抗體及其制備方法與應用。

背景技術

多菌靈(carbendazim,CAS:10605-21-7)是一種廣譜性的苯并咪唑類殺菌劑，對多種作物由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的病害有防治效果。多菌靈為結晶狀粉末，熔點為302~307℃(分解)，蒸氣壓為0.09mPa(20℃)，密度為1.45(20℃)，水中的溶解度為29mg/L(pH4，24℃)，二甲基甲酰胺中的溶解度為5g/L(24℃)，微溶于有機溶劑中，低于50℃至少兩年穩定，在堿性溶液中緩慢分解，隨pH值升高，分解加快，在酸中穩定。其化學結構式如式Ⅰ所示：

（式Ⅰ）

雖然多菌靈為低毒類農藥，但被廣泛使用，我出口德國的脫水蘑菇中被多次檢出有“多菌靈”殘留，在1~10mg/kg左右，其達不到歐盟標準。歐盟于2007年2月26日發布了關于對90/642/EEC法規的修訂案。其中關于多菌靈在新鮮菇類中的MRLs（最大殘留量），由1mg/kg加嚴到0.1?mg/kg；干菇類中的MRLs，由10?mg/kg加嚴到1?mg/kg。我國和其它國家針對多菌靈在食品中的MRLs有明確規定，介于0.09-3?mg/kg之間。因此對于多菌靈的準確檢測非常重要。

常用的檢測方法有液相色譜法，競爭酶聯免疫吸附法（ELISA），膠體金試紙檢測等。液相色譜法儀器設備昂貴，并且操作復雜，對操作人員的要求較高，雖然檢測準確，但并不適合廣泛推廣；膠體金法檢測快速，價格便宜，但靈敏度低且容易出現假陽性；與以上兩種方法相比，ELISA試劑盒法操作簡便、快速，無需專業人員操作，僅需配備基礎儀器設備，因此非常適合在食品企業中推廣，同時由于其適合大批量樣本篩選，因此配合儀器，可廣泛應用于檢驗檢疫、商檢執法等部門，是非常具有推廣價值的食品安全快速篩查方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種多菌靈的單克隆抗體及其制備方法和應用。

為解決上述技術問題，本發明所提供的技術方案如下：

一種多菌靈的單克隆抗體，是由保藏號為CGMCC?No.?4575的小鼠雜交瘤細胞株MC-3產生。

能分泌抗多菌靈單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株MC-3，已于2011年2月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址是中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號），其分類命名為：Balb/C小鼠雜交瘤細胞株，保藏編號為CGMCC?No.4575。

本發明還提供一種上述多菌靈的單克隆抗體的方法，該方法包括以下步驟：

（1）在多菌靈的第9位氨基酸殘基引入1個氨基，得到經氨基修飾的多菌靈，再將該經氨基修飾的多菌靈與載體蛋白偶聯得到完全抗原A；

（2）將步驟（1）的完全抗原A免疫小鼠，取免疫小鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞株；擴大培養該陽性雜交瘤細胞株，將陽性細胞株注入同系小鼠腹腔誘導產生腹水，得到多菌靈的單克隆抗體。

其中，所述步驟（1）中，采用乙二醇法在多菌靈的第9位氨基酸殘基引入1個氨基。

所述步驟（1）中，所述完全抗原A中的載體蛋白可為任意一種常用的載體蛋白，例如牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HAS）、鑰孔血藍蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）等，優選為鑰孔血藍蛋白（KLH）。

所述步驟（2）中，用于免疫的小鼠為Balb/C小鼠；免疫方法為：每只小鼠每次免疫所用的完全抗原A量為40μg~80μg，兩次免疫的間隔時間為20~30天；免疫方式為皮下多點注射；

所述步驟（2）中，小鼠骨髓瘤細胞具體可為小鼠骨髓瘤細胞sp2/0。

所述步驟（2）中，篩選陽性雜交瘤細胞株的方法具體為：先用包被抗原篩選1~2次，再用偶聯有載體蛋白的無關小分子篩選至少1次；所述包被抗原為所述步驟（1）中的多菌靈與載體蛋白偶聯得到的完全抗原B；所述完全抗原B與所述完全抗原A中的載體蛋白不相同。

當完全抗原A中的載體蛋白為鑰孔血藍蛋白時，所述完全抗原B中的載體蛋白具體可為牛血清白蛋白、人血清白蛋白或卵清白蛋白。

所述偶聯有載體蛋白的無關小分子可以為丁酰-BSA，苯菌靈-BSA，甲基硫菌靈-BSA（與多菌靈偶聯方法一致）。

本發明利用上述免疫方法和篩選方法，用完全抗原A免疫小鼠，得到了只針對完全抗原上小分子多菌靈的抗體。

所述陽性雜交瘤細胞株為能分泌抗多菌靈單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株MC-3，其保藏號為CGMCC?No.?4575。