[發明專利]用于靈菌紅素生物合成的縮合酶

無效

• 申請號: 201110051722.6
• 申請日: 2011-03-04
• 公開（公告）號: CN102653732A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 劉曉俠;王玉潔;孫詩清
• 申請（專利權）人: 嘉興學院
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 盧剛

技術領域

本發明屬于生物制藥相關的基因工程領域，涉及一種用于靈菌紅素生物合成的縮合酶。

背景技術

靈菌紅素是一類主要由一些放線菌、沙雷氏菌及其它海洋細菌產生的具有重要生物活性的典型次級代謝產物。含甲氧基三吡咯環組成的基本骨架結構，具有抗細菌、抗瘧疾、抗真菌、抗原生動物等生物活性。近年來，發現其具有特效的免疫抑制和抗癌活性，其中靈菌紅素類似物GX15-070(Obatoclax)，在臨床上已被用于治療多種癌癥，主要作用機理在于：①作為細胞內pH值調節器；②具有銅離子誘導DNA裂解活性；③激活蛋白激酶(MAPK)作為細胞有絲分裂的調節劑；④作為細胞周期的抑制劑。另外國內外研究還表明靈菌紅素及其類似物在水體污染治理，特別是由各種藻類造成的海洋赤潮和淡水水華等方面具有極佳的治理效果，且不會給水體環境帶來二次污染。靈菌紅素及其類似物作為生態染料，在羊毛、腈綸等紡織品染色方面，具有較好的色牢度、上染率及抗菌性能。

基于靈菌紅素特效免疫抑制和抗癌活性，它的合成成為研究的熱點。現主要采用兩種途徑：化學合成和生物合成。①化學合成法從二十世紀六十年代，就有關于靈菌紅素化學合成的報道，后來研究者陸續報道了不同工藝路線，大多是通過對現有的靈菌紅素分子進行化學改性，合成新的靈菌紅素類似物，已有研究表明通過化學合成的一些靈菌紅素結構類似物較靈菌紅素更為高效低毒，比如類似物GX15-070(Obatoclax)，已進入II期臨床試驗，但產量產率均較低。

生物法合成靈菌紅素具有對環境友好、成本低等優點，備受關注。目前國內外較多關于發酵生產靈菌紅素的研究報道，主要從菌株選育、營養條件、環境因素、培養方式、反應設備等方面進行考察，產量差異很大。通過對靈菌紅素的生物合成途徑深入研究，發現在參與靈菌紅素的基因約有二十個左右，在不同生物體中不盡相同，但均組成基因簇。主要存在四種不同的基因簇組成，每個基因簇基因組成。一些研究表明組成靈菌紅素合成的基因簇的一些酶，表現出對底物利用和產物形成的靈活性，其中催化靈菌紅素合成最終步驟的靈菌紅素縮合酶PigC，在催化前體2-甲基-3-戊基吡咯(MAP)和4-甲氧基-2，2′-二吡咯-5-羧甲基乙醛(MBC)合成中靈菌紅素過程中，也表現出松弛的底物專一性，具有催化前體類似物合成靈菌紅素類似物的能力，屬于典型的混雜酶，在利用組合生物合成方法開發靈菌紅素類似物中將起到關鍵作用，并在混雜酶機理研究及生物制藥方面具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于靈菌紅素生物合成的縮合酶，實現開發高效合成靈菌紅素及類似物的基因產品奠定基礎。

本發明所述的一種用于靈菌紅素生物合成的縮合酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其相應的DNA序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明從Serratia?marcescens菌株中提取總DNA，采用分段克隆方法獲得靈菌紅素縮合酶基因全長，分析測定核苷酸序列并研究其特性。

第一步，基因組DNA提取：

將Serratia?marcescens?jx-1(中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為：CGMCC4074)菌種過夜培養于LB液體培養基中，收集菌體重懸于TE溶液中，分別利用溶菌酶、蛋白酶K和10％SDS裂解菌體，再采用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提去除蛋白質，重復兩次，再用0.6倍體積的異丙醇沉淀，用75％的乙醇洗滌，自然風干，加適量ddH₂O溶解，4℃儲存備用。

第二步，PCR分段擴增：

我們根據Genbank數據庫中公布來源于Serratia?marcescens的PigC序列，利用Premier5.0軟件設計了四條引物，分別為：引物1：5’-tggatccgaggtgatgtcatgaatc-3’(BamHI)，引物2：5’-agccccatggttttgatcgccgggccatg-3’(NcoI)，引物3：5’-cccggcgatcaaaaccatggggct-3’(NcoI)，引物4：5’-taaagcttcgcatcaccttcgttg-3’(HindIII)。采用分段克隆的方法，獲得PigC基因的全片段。

第三步，大腸桿菌感受體細胞的制備：