[發(fā)明專利]一種應(yīng)用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110043562.0
• 申請日: 2011-02-23
• 公開（公告）號: CN102154486A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸根法;吳以中;戴明忠;劉寧;夏晶;朱沁園
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 汪旭東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種確定水體遺傳毒性的方法，更具體的說是一種應(yīng)用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法。

背景技術(shù)

遺傳標(biāo)記是生物遺傳分析的基礎(chǔ)和遺傳分析方法。遺傳標(biāo)記（Genetic?marker）是指那些表現(xiàn)變異性，且遵循簡單遺傳方式的性狀或物質(zhì)，是任何遺傳分析所不可缺少的工具。它是進(jìn)行遺傳分析、群體遺傳學(xué)研究、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化與分類研究中不可缺少的工具。

RAPD是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)的一種，是1990年Williams和Welsh等各自獨(dú)立地首先運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標(biāo)記，并將這一方法命名為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA?(random?amplified?polymorphic?DNA,?RAPD)。RAPD標(biāo)記技術(shù)是建立于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)基礎(chǔ)之上，用寡核苷酸序列為引物，通過專門的PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得長度不同的多態(tài)性DNA片段。不同物種的基因組中與某一引物相匹配的堿基序列的空間位置和數(shù)目都可能不同，因而擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和數(shù)量也可能不同，用適當(dāng)選擇的一系列人工合成的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為10聚體）為引物，以目標(biāo)基因組DNA或RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

RAPD標(biāo)記技術(shù)具有以下優(yōu)點：(1)無需預(yù)先知道研究對象的基因組核苷酸序列，無需專門設(shè)計的擴(kuò)增引物，一套商售的引物即可滿足RAPD分析的要求；(2)RAPD分析直接以基因組DNA為分析對象，無需像RFLP那樣進(jìn)行預(yù)備性工作—克隆制備和篩選、同位素標(biāo)記、Southern印記和分子雜交等步驟，方法簡便易行；(3)RAPD分析適用于自動化程序分析，結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠。目前，?RAPD由于其自身特點而得到廣泛應(yīng)用，比如，在物種分類和進(jìn)化和污染物的遺傳毒性分析研究領(lǐng)域。

但是，目前RAPD在遺傳毒性方面僅發(fā)揮了很小的一部分的作用，只要和合適的分析工具、嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化試驗條件相結(jié)合，RAPD技術(shù)將會是一種可靠、靈敏、重復(fù)性強(qiáng)的分析方法，并可探測出DNA的多種損傷，包括DNA加合物、DNA損傷、突變等，其在遺傳毒性領(lǐng)域必將大有可為。

發(fā)明內(nèi)容

1、本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，更好的評價飲用水源水的遺傳毒性，為各類水質(zhì)評價提供生物信息學(xué)參考。

2、技術(shù)方案

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種應(yīng)用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，其步驟為：

（1）采用待分析飲用水源水飼喂小鼠，并分別以純凈水與一定濃度的毒性物質(zhì)溶液飼喂的小鼠作為陰性對照與陽性對照；

（2）提取小鼠DNA，選用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳分析，分別以隨機(jī)引物對小鼠的肝臟細(xì)胞基因組進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，并對擴(kuò)增條帶進(jìn)行多態(tài)性分析。

步驟（2）采用電泳并拍照后獲得電泳圖片條帶進(jìn)行所述的多態(tài)性分析。

RAPD的反應(yīng)體系為50ngDNA模板，10×buffer2.5μl，dNTP200μmol/L，Mg2+2.5mmol/L，引物0.8μmol/L，Taq酶2U；用滅菌雙蒸水將體積補(bǔ)至25μl。

RAPD擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，35℃退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)后72℃延伸10min。

通過以上技術(shù)方案擬解決以下問題：通過對不同處理組小鼠的遺傳分析，證實水源對小鼠肝臟基因組是否存在遺傳毒性及遺傳毒性的大小；根據(jù)獲得的基因組多態(tài)性結(jié)果，預(yù)測水源水對人類基因組的影響，并初步評價水源水的遺傳毒性，為水源水的水質(zhì)評價提供生物信息學(xué)參考。

3、有益效果

本發(fā)明提供了一種應(yīng)用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，可以確定飲用水源水對小鼠基因組DNA的影響，從整體評價和預(yù)警其可能產(chǎn)生的遺傳毒性，同時，證實了RAPD技術(shù)在遺傳毒性研究領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)越性和可行性。本發(fā)明為飲用水源水的質(zhì)量控制以及沿岸治理提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為部分引物擴(kuò)增得到的RAPD圖譜，其中A:水源水組，B：CK組，C：Bap組，O：空白組（以滅菌雙蒸水代替DNA模板所配成的體系）。

圖2為UPGMA法對9只小鼠進(jìn)行聚類分析。

圖3?為UPGMA法對Nei’s遺傳距離分類聚態(tài)圖。

具體實施方式

以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。

1?實驗設(shè)計

本實驗采用雄性小鼠(Mus?musculus,?ICR)作為實驗對象，小鼠3～4周齡，體重18?±?1g。