[發明專利]存活素酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201110034400.0
• 申請日: 2011-02-01
• 公開（公告）號: CN102181401A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 張青云
• 申請（專利權）人: 北京市腫瘤防治研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/18;G01N33/577;G01N33/574
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種Survivin酶聯免疫試劑盒及其在膀胱癌患者尿Survivin檢測中的應用。

背景技術

膀胱癌是國內泌尿系統中最常見惡性腫瘤，90％以上為移行上皮癌，其中約70％為表淺性，20％為浸潤性，早期診斷較困難，5％確診時已發生轉移。膀胱癌診治后容易復發，且復發腫瘤惡性度增加，故治療后需終身嚴密的隨訪。

目前膀胱鏡檢查及可疑病變處活檢仍是膀胱癌診斷和隨訪的金標準。但是膀胱鏡檢查會帶給患者創傷且檢測費用昂貴，同時細胞學檢查敏感性低，盡管其特異性能到達94％而相應的敏感性只有35％。細胞學檢測的低靈敏性與膀胱鏡檢的侵入性使得人們對一些非浸入性診斷方法產生了較大興趣。在過去的的幾十年，生物標志物的發展給我們帶來了一些新的膀胱癌檢測與隨訪的方法。

Survivin是1997年Altieri等在研究效應細胞蛋白酶受體-1(effector?cell?protease?receptor-1，EPR-1)cDNA，在人類基因組庫中篩選克隆時首先被發現，因其具有強大的抗細胞凋亡功能，被命名為“存活素或生存素”。

Survivin作為一種新型的腫瘤標志物，有報道在膀胱癌的診斷中有比較好的敏感性與特異性，但未完全證實。

目前對Survivin檢測方法主要有RT-PCR，Real-time?PCR及酶聯免疫(ELISA)。RT-PCR雖然靈敏，但容易污染。它只是一種定性的檢測，且操作繁瑣。Real-time?PCR采用獨特封閉反應，減少了污染，可靠性高，且操作時間短，但該檢測的設備與試劑昂貴限制了它的使用與普及。ELISA以抗體包被微孔板的形式，具有靈敏度高，費用低，大通量，在腫瘤標志物的檢測中使用比較常見。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種存活素(Survivin)單克隆抗體，酶聯免疫試劑盒及其在膀胱癌尿檢中的應用。

本發明提供的存活素單克隆抗體是由雜交瘤細胞株BCHJYS10產生的，是通過大腸桿菌制備的Survivin蛋白，再用純化的蛋白作為免疫原免疫Balb/c小鼠，然后篩選出的雜交瘤細胞株。本發明提供的雜交瘤細胞株BCHJYS10，已于2011年01月29號在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，保藏號為CGMCCNo.4574。

本發明還提供含有所述的雜交瘤細胞株BCHJYS10產生的單克隆抗體或生物素標記的所述的單克隆抗體的Survivin酶聯免疫試劑盒。

本發明提供的Survivin的酶聯免疫試劑盒，它還包括：酶標板、存活素標準品、酶標二抗或酶標親和素、存活素多克隆抗體或生物素標記的多克隆抗體、底物顯色液、終止液、洗滌液、稀釋液；其中，包被酶標板所用的緩沖液為0.02～0.05mol/L的碳酸緩沖液，pH值為9.1～9.9；所用的封閉液為含有1～100mg/ml脫脂奶粉的PBS溶液。

本發明所述的試劑盒中特異性抗體為Survivin單克隆抗體或多克隆抗體，濃度為0.1～20μg/ml，優選為1～5μg/ml；生物素標記的Survivin單克隆抗體或多克隆抗體的濃度為0.1～20μg/ml，優選為1～5μg/ml。

本發明所述的試劑盒中，用于標記的生物素與單克隆抗體或多克隆抗體按質量比1∶1～4結合，優選為1∶2。

本發明所述的試劑盒中生物素標記的抗體是按照如下方式制備的：

1)將NHS-Biotin(N-羥基丁二酰亞胺酯化生物素)5mg溶于0.5ml?DMSO中，最終濃度為10mg/ml；

2)濃度在1mg/ml以上的單抗或多抗，標記前在碳酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH8.2-8.6)中充分透析。4℃1-2h，1L碳酸緩沖液，可攪拌；

3)biotin與單抗或多抗的質量比為1∶2，即1mg單抗或多抗加入500μg的生物素酯(NHS-Biotin-DMSO液50μl)混勻后，室溫避光旋轉混勻4小時；

4)以PBS充分透析除去游離生物素，標記抗體凍存。

本發明所述的試劑盒，當Survivin單抗作為包被抗體時，Survivin多抗或生物素標記的Survivin多抗作為捕獲抗體；當Survivin多抗作為包被抗體時，Survivin單抗或生物素標記的Survivin單抗作為捕獲抗體。