[發明專利]紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法

無效

• 申請號: 201110033701.1
• 申請日: 2011-01-31
• 公開（公告）號: CN102124955A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 梁慧敏;夏陽;燕麗萍;朱曉花;李雙云;劉翠蘭;劉艷;劉進華
• 申請（專利權）人: 江蘇農林職業技術學院;山東省林業科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林;嚴志平

1.一種紅葉石楠離體葉片體細胞胚誘導快繁培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）建立紅葉石楠無菌試管苗再生體系：

（1.1）選材與材料處理：于春季晴天上午選取生長健壯、性狀表現優良的單株，用5%多菌靈噴灑選取的枝條，每周噴灑一次，連續噴灑一個月，之后剪取剛萌發的無病蟲嫩枝，包括前端未木質化和半木質化部分，除去多余的莖葉，將需要部分用洗潔精溶液浸泡5-10min，然后用棉球仔細清洗后，再用流水沖洗1小時，最后用2%NaClO溶液浸泡15-20min,再用無菌水沖洗干凈，用滅菌濾紙吸干水分后備用；

（1.2）選材消毒與芽啟動萌發培養：將步驟（1.1）所述的處理過的材料置于超凈工作臺上，用75％的酒精消毒15-20s，無菌水沖洗5-6次，再用0．1％升汞滅菌8-15min，無菌水沖洗6—8次，用滅菌濾紙吸干水分，然后剪取1-2cm左右帶一個腋芽或頂芽的莖段，以生態學下段垂直插入芽啟動培養基上，每瓶接種3個外植體，誘導頂芽和腋芽萌發，在培養室溫度白天25±2℃?，夜晚20±2℃，光照強度1500—2000?lx，光照時間14?h／d的條件下，進行15-20d的培養，莖段腋芽開始萌動，莖尖明顯伸長，40-50d后芽點長成2-4cm的新梢，形成無菌試管苗；

（1.3）無菌試管苗增殖培養：將步驟（1.2）誘導出的無菌試管苗去掉基部葉片，切成含1-2個腋芽的莖段或莖尖接種在試管苗增殖培養基上，25-28d后繼代1次，通過上述試管苗增殖培養基的NAA濃度在0.1～0.5mgL^-1的可控范圍內調整變化，獲得大量無菌試管苗，建立起紅葉石楠無菌試管苗再生體系；

（2）建立離體葉片體胚和不定芽誘導的高頻快繁體系：

（2.1）誘導體胚和不定芽的形成：以試管苗第3到第6片展開葉為外植體，葉片帶短葉柄，將葉片周圍帶鋸齒狀葉緣切去，之后做以下處理：一、葉片沿主脈切成左右兩半，視葉片大小輕劃1-2刀；二、葉片沿主脈橫切2-3刀，分別接種在第一誘導體胚和/或不定芽形成培養基、第二誘導體胚和/或不定芽形成培養基和第三誘導體胚和/或不定芽形成培養基上，要求外植體葉背朝下緊貼各自的培養基放置，于黑暗培養7-10d，誘導體胚的形成，于黑暗培養15-20d，誘導不定芽的形成；

（2.2）體胚和不定芽的生長與分化：將第一誘導體胚和/或不定芽形成培養基和第二誘導體胚和/或不定芽形成培養基上培養的外植體轉接到第一體胚和/或不定芽生長與分化培養基上，然后放入人工氣候箱，溫度為10±2℃時，暗培養3-5d之后轉入培養室暗培養35-40d，或直接在培養室暗培養40-45d，中間繼代一次；而將第三誘導體胚和/或不定芽形成培養基上的外植體轉接到第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基上，在培養室培養40-45d，中間繼代一次，光照強度1000—1500lx，經過上述第一體胚和/或不定芽生長與分化培養基和第二體胚和/或不定芽生長與分化培養的培養，在外植體上形成許多叢生芽，芽高在2cm～5cm；

（2.3）叢生芽增殖快繁培養：將上述步驟（2.2）誘導形成的叢生芽切成含1-2個腋芽的莖段或莖尖轉接到試管苗增殖培養基或第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基上交替繼代，進行增殖快繁培養，每18-22d繼代一次，增殖頻率為10-15；

（3）試管苗生根煉苗移栽：

（3.1）壯苗生根培養：

將上述步驟（2.3）生長發育健壯的長到3-4cm后的叢生芽切成單株轉接到壯苗生根培養基上，培養25-35d，保證莖葉發育正常，根系生長健壯，根長至1.5cm以上時，進行煉苗移栽；

（3.2）煉苗移栽：

首先將試管苗瓶蓋打開，在培養室適應1d后移到遮光度70-80%的遮蔭網塑料大棚,在溫室條件下煉苗2-3d，用鑷子將苗夾出，清水洗去基部殘留的培養基，移栽到裝有混合育苗基質的穴盤中，利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對濕度在80%以上，經馴化煉苗5-10d后，在新根新芽萌出后，逐漸減少澆水次數并移栽到花盆進行常規管理；

所述的芽啟動培養基為：改良MS?+?0.5～1.0?mgL^-1BA?+?0.5～1.0mgL^-1KT?+?0.1～0.2mgL^-1NAA?+?6.0～7.0gL^-1瓊脂?+?30gL^-1蔗糖,?且pH值為5.8～6.0；

所述的試管苗增殖培養基為：改良MS?+?1.0～2.0mgL^-1BA?+?1.0～2.0mgL^-1KT??+?0.1～0.5mgL^-1NAA?+?6.0～7.0gL^-1瓊脂?+?30gL^-1蔗糖,?且pH值為5.8～6.0；

所述的第一誘導體胚和/或不定芽形成培養基為：改良MS?+?0.5mgL^-12,4-D?+?0.5～1.0mgL^-1BA?+?0.5～2.0mgL^-1NAA?+?3.0～3.5gL^-1phytagel?+?20gL^-1蔗糖,?且pH值為5.8～6.0；

所述的第二誘導體胚和/或不定芽形成培養基為：改良MS?+?0.1mgL^-12,4-D?+?0.5mgL^-1BA?+?10～30?mgL^-1NAA?+?3.0～3.5gL^-1phytagel?+?20gL^-1蔗糖,?且pH值為5.8～6.0；

所述的第三誘導體胚和/或不定芽形成培養基為：改良MS?+?2.0～4.0mgL^-1?NAA?+?0.2～0.5mgL^-12,4-D?+?0.5～2.0mgL^-1BA+?0.5～2.0?mgL^-1KT+?6.0～7.0gL^-1瓊脂?+?30gL^-1蔗糖,?且pH值為5.8～6.0；

所述的第一體胚和/或不定芽生長與分化培養基為：改良MS?+?2.0～4.0mg?L^-1BA?+?3.0～3.5gL^-1phytagel?+?20gL^-1蔗糖,且pH值為5.8～6.0；

所述的第二體胚和/或不定芽生長與分化培養基為：改良MS?+?2.0mgL^-1?BA?+?1.0?mgL^-1?IBA?+?2.0?mgL^-1?KT?+?6.0～7.0gL^-1瓊脂?+?30gL^-1蔗糖,?且pH值為5.8～6.0；

所述的壯苗生根培養基為：1/2改良MS?+?0.2～0.5mgL^-1?IBA?+?0～0.05mgL^-1NAA?+?6.0～7.0gL^-1瓊脂?+?20gL^-1蔗糖,?且pH值為5.8～6.0。