[發(fā)明專利]基于巴氏杜氏藻代謝途徑的番茄紅素工程菌及構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110008676.1
• 申請日: 2011-01-14
• 公開（公告）號: CN102154329A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜建國;葉志偉;勞永民
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12P23/00;C12R1/19
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于巴氏杜氏藻代謝途徑的番茄紅素工程菌及構(gòu)建方法，具體地說涉及從巴氏杜氏藻(Dunaliella?bardawil)中獲取八氫番茄紅素合成酶(Psy)、八氫番茄紅素脫氫酶(Pds)、ζ-胡蘿卜素脫氫酶(Zds)等基因的cDNA并構(gòu)建出高產(chǎn)番茄紅素的工程菌。

背景技術(shù)

類胡蘿卜素是具有共軛聚烯結(jié)構(gòu)的一類物質(zhì)。在醫(yī)學(xué)上，類胡蘿卜素具有預(yù)防和治療心血管疾病、白內(nèi)障以及某些癌癥等功能。此外，類胡蘿卜素也被廣泛應(yīng)用于動物飼料、食物和化妝品中。營養(yǎng)保健、醫(yī)藥、食品以及化妝品上的廣泛應(yīng)用使得類胡蘿卜素在世界范圍內(nèi)有著較高的需求量。番茄紅素對單線態(tài)氧的猝滅能力分別是β-胡蘿卜素和α-生育酚的2倍和100倍。流行病學(xué)還發(fā)現(xiàn)番茄紅素能降低癌癥和冠心病等慢性疾病的發(fā)生幾率。據(jù)市場研究機(jī)構(gòu)調(diào)查顯示，2004年的類胡蘿卜素的市場銷售總額為8.869億美元，到2009年它將突破10億美元。巴氏杜氏藻(Eukaryota總界、Viridiplantae界、Chlorophyta門、Chlorophyceae綱、Chlamydomonadales目、Dunaliellaceae科、Dunaliella屬)在應(yīng)激條件下能夠大量積累β-胡蘿卜素，其含量最高可超過干重的10％。因此，從分子生物學(xué)角度構(gòu)建帶杜氏藻類胡蘿卜素合成基因的高產(chǎn)工程菌株有著重大的社會和經(jīng)濟(jì)意義。分子生物學(xué)分析顯示，類胡蘿卜素途徑的酶是單一的基因產(chǎn)物，它們催化特定的反應(yīng)。從番茄紅素到玉米黃素或者α-胡蘿卜素不需要所有酶一齊起作用。此外，不同的酶組合形成的途徑產(chǎn)生各種各樣的類胡蘿卜素。因此，利用杜氏藻類胡蘿卜素途徑的相關(guān)基因，通過相關(guān)基因工程手段來構(gòu)建類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株對提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量具有根本上的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于巴氏杜氏藻代謝途徑構(gòu)建的番茄紅素工程菌及構(gòu)建方法。本發(fā)明通過利用相關(guān)基因工程手段獲取巴氏杜氏藻類胡蘿卜素合成途徑的八氫番茄紅素合成酶(Psy)、八氫番茄紅素脫氫酶(Pds)、ζ-胡蘿卜素脫氫酶(Zds)等基因的cDNA，并利用p15A復(fù)制起始位點(diǎn)，氯霉素抗性基因以及巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動子構(gòu)建出質(zhì)粒pDbcrtA。轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia?coli)DH5α(Bacteria總界、Proteobacteria門、Gammaproteobacteria綱、Enterobacteriales目、Enterobacteriaceae科、Escherichia屬、Escherichia?coli種)(細(xì)菌呈白色)后獲得一種呈粉紅色的番茄紅素高產(chǎn)工程菌Escherichia?coli?DH5α(pDbcrtA)。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

基于巴氏杜氏藻代謝途徑的番茄紅素工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)從巴氏杜氏藻中獲取相關(guān)基因的cDNA

從對數(shù)生長期的巴氏杜氏藻中提取總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶以18個T的寡聚核苷酸為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得巴氏杜氏藻的總cDNA；

以巴氏杜氏藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游引物P1：5’-CCGCTCGAGATGGCACAGCGAACAGCAAC-3’和下游引物P2：5’-CCATCGATGGGACGCGTTTATTTGTTCTTGGGCAC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy基因的cDNA；

以巴氏杜氏藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游引物P3：5’-CGACGCGTATGCAGGTTATGCAGGGCAGG-3’和下游引物P4：5’-CCATCGATGATCGATCGTTAGAACCAAGGGAAGG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到巴氏杜氏藻八氫番茄紅素脫氫酶Pds基因的cDNA；

以巴氏杜氏藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游引物P5：5’-ATCGATCGATGTTGGGGCTGCACAGCAAGG-3’和下游引物P6：5’-CCATCGATGGGCTTAAGTTACATGCTCGGAAGTG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到巴氏杜氏藻ζ-胡蘿卜素脫氫酶Zds基因的cDNA；

(2)巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動子的獲取