[發(fā)明專利]基于巴氏杜氏藻代謝途徑的番茄紅素工程菌及構(gòu)建方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201110008676.1
• 申請日: 2011-01-14
• 公開（公告）號: CN102154329A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜建國;葉志偉;勞永民
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12P23/00;C12R1/19
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1.基于巴氏杜氏藻代謝途徑的番茄紅素工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)從巴氏杜氏藻中獲取相關(guān)基因的cDNA

從對數(shù)生長期的巴氏杜氏藻中提取總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶以18個T的寡聚核苷酸為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得巴氏杜氏藻的總cDNA；

以巴氏杜氏藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游引物P1：5’-CCGCTCGAGATGGCACAGCGAACAGCAAC-3’和下游引物P2：5’-CCATCGATGGGACGCGTTTATTTGTTCTTGGGCAC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy基因的cDNA；

以巴氏杜氏藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游引物P3：5’-CGACGCGTATGCAGGTTATGCAGGGCAGG-3’和下游引物P4：5’-CCATCGATGATCGATCGTTAGAACCAAGGGAAGG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到巴氏杜氏藻八氫番茄紅素脫氫酶Pds基因的cDNA；

以巴氏杜氏藻總cDNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游引物P5：5’-ATCGATCGATGTTGGGGCTGCACAGCAAGG-3’和下游引物P6：5’-CCATCGATGGGCTTAAGTTACATGCTCGGAAGTG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到巴氏杜氏藻ζ-胡蘿卜素脫氫酶Zds基因的cDNA；

(2)巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動子的獲取

從對數(shù)生長期的巴氏杜氏藻中提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用PrimeSTAR?HS?DNA聚合酶，以上游引物P7：5’-GGTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGC-3’和下游引物P8：5’-CCATCGATCCGCTCGAGCCTACACACAGAGGAAG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動子；

(3)p15A復(fù)制起始位點和氯霉素抗性基因的獲取

依次用內(nèi)切酶Cla?I在30℃下和Hind?III在37℃下對質(zhì)粒pVA838處理1h后，純化并回收DNA片段；利用T4?DNA聚合酶對獲取的DNA片段進(jìn)行平末端化，純化并回收DNA產(chǎn)物，利用T4?DNA連接酶使DNA自身環(huán)化為質(zhì)粒pcmp15A，質(zhì)粒pcmp15A轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行增殖；

(4)質(zhì)粒的構(gòu)建

純化后的巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動子DNA片段在T4?DNA連接酶作用下與經(jīng)純化和堿性磷酸酶處理過的質(zhì)粒pcmp15A的DNA片段進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pDbA；

依次用內(nèi)切酶Xho?I在37℃下和Cla?I在30℃下對質(zhì)粒pDbA和純化后的巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy基因的cDNA處理1h，純化并回收DNA片段；接著兩者在T4?DNA連接酶作用下形成質(zhì)粒pDbB；

依次用內(nèi)切酶Mlu?I在37℃下和Cla?I在30℃下對質(zhì)粒pDbB和純化后的巴氏杜氏藻八氫番茄紅素脫氫酶Pds基因的cDNA處理1h，純化并回收DNA片段；接著兩者在T4?DNA連接酶作用下形成質(zhì)粒pDbC；

依次用內(nèi)切酶Cla?I在30℃下和Pvu?I在37℃下對質(zhì)粒pDbC和純化后的巴氏杜氏藻ζ-胡蘿卜素脫氫酶Zds基因的cDNA處理1h，純化并回收DNA片段；接著兩者在T4?DNA連接酶作用下形成質(zhì)粒pDbcrtA；質(zhì)粒pDbcrtA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后獲得番茄紅素工程菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述質(zhì)粒pcmp15A的純化和堿性磷酸酶處理是利用內(nèi)切酶EcoR?V對質(zhì)粒pcmp15A在37℃下處理1h后，純化并回收DNA片段，再用堿性磷酸酶對回收的DNA片段進(jìn)行去磷酸化，純化并回收DNA片段；

所述巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動子的純化是利用T4?DNA聚合酶對獲取的巴氏杜氏藻八氫番茄紅素合成酶Psy啟動子進(jìn)行平末端化。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述反轉(zhuǎn)錄獲得巴氏杜氏藻的總cDNA的反應(yīng)程序為：42℃，1h；70℃，15min。

4.一種由權(quán)利要求1～3任意一項所述的方法制得的番茄紅素工程菌，菌株為大腸桿菌(Escherichia?coli)DH5α(pDbcrtA)，呈粉紅色。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的番茄紅素工程菌，其特征在于，該菌株利用巴氏杜氏藻的八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、ζ-胡蘿卜素脫氫酶來合成番茄紅素。