[發(fā)明專(zhuān)利]一種高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110006213.1
• 申請(qǐng)日: 2011-01-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102154190A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛自朝;楊發(fā)祥;尚海麗;程倩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 昆明正原專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 53100
• 代理人: 金耀生

1.一種高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌，其特征在于其分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌（Escherichia?coli），保藏號(hào)為CGMCC?No.3926。

2.權(quán)利要求1所述的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行：

（1）構(gòu)建含有透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá)載體pQEpmHas，用PCR擴(kuò)增方法克隆源自多殺巴斯德菌（Pasteurella?multocida?subsp.?Multocida）中的透明質(zhì)酸合成酶基因（Pasteurella?multocidahyaluronic?acid?synthase?PmHas），?其PCR擴(kuò)增克隆所用引物設(shè)計(jì)如下:

上游引物pmHas?P1?為?5'-TAGGATCCATGAACACATTATCACAAGCAAT-3'(序列表中SEQ?ID?No:3)，含Bam?H?I位點(diǎn)GGATCC和起始密碼子ATG；

下游引物為pmHasP2?為?5'-TAGAGCTCTTATAGAGTTATACTATTAATAAT-3'(序列表中SEQ?ID?No:4)，含Sac?I位點(diǎn)GAGCTC和終止密碼子TAA；

PCR的模版為多殺巴斯德菌菌株ATCC?15742的基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Bam?H?I和Sac?I雙酶切后,連接入商用載體pQE80L中的相同酶切位點(diǎn)，插入片段經(jīng)DNA?測(cè)序確證無(wú)突變后,將所獲載體命名為pQEpmHas，基因?yàn)?i>pmHas（序列表中SEQ?ID?No:1）；

（2）構(gòu)建含尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的表達(dá)載體pQEkfiD，用PCR擴(kuò)增方法克隆源自源于大腸桿菌（Escherichia?coli，E.coli）菌株k5中鳥(niǎo)苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因（K₅?capsule?gene?D，kfiD），擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)如下:

上游引物KfiD?P1:?5'-?TGGAGATCTATGTTCGGAACACTAAAAATAACT?G-3'(序列表中SEQ?ID?No:5)，含Bgl?II?位點(diǎn)AGATCT，和起始密碼子ATG)；

下游引物kfiD?P2：?5'-TTCTCGAGTTAGTCACATTTAAA?CAAATCGCGAC-3'(序列表中SEQ?ID?No:6)，含Xho?I位點(diǎn)CTCGAG和終止密碼子TAA?；

PCR的模版為大腸桿菌菌k5菌株ATCC?23500的基因組ＤＮＡ,成功擴(kuò)增并純化的產(chǎn)物,?經(jīng)Ｂgl?II和Xho?I雙酶切后,連接入Qiagen?公司的商用載體pQE80L的Bam?H?I和Sal?I位點(diǎn),所得載體經(jīng)DNA?測(cè)序分析確證插入片段無(wú)突變后，所獲載體命名為pQEkfiD，相應(yīng)基因命名為kfiD基因（序列表中SEQ?ID?No:2）；

（3）構(gòu)建大腸桿菌中共同表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組載體：

根據(jù)構(gòu)建好的pQEkfiD載體的DNA?序列設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增T5?啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)kfiD表達(dá)的片段?T5:kfiD，引物序列設(shè)計(jì)如下：??

上游引物T5kfiD?P1：5'-TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCAC_GTCGAGA-3'（序列表中SEQ?ID?No:7），該引物含有Sac?I?位點(diǎn),GAGCTC，其中下標(biāo)G?表示將原始pQE80L載體中C突變?yōu)镚，以消除其Xhol?位點(diǎn),CTCGAG；

下游引物T5kfiD?P2：5'-TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT-3'（序列表中SEQ?ID?No:8），該引物含?Xho?I?site,?CTCGAG?；?

PCR的模版用pQEkfiD載體，純化的T5:kfiD擴(kuò)增產(chǎn)物,?首先連接入pGEM-T-Vector并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，獲中間載體pT-T5KfiD，該載體中T5:kfiD（序列表中SEQ?ID?No:9）片段，經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)核苷酸順序無(wú)突變后，該插入pT-T5KfiD片段經(jīng)Sac?I和Xho?I?雙酶切后,連接入表達(dá)載體pQEpmHas的Sac?I和sal?I?位點(diǎn)而獲pmHas和kfiD基因在大腸桿菌中共表達(dá)的重組載體pQHK?；?

（4）表達(dá)載體pHK的構(gòu)建

用德國(guó)MoBiTec公司的革蘭氏陰性菌宿主廣譜質(zhì)粒pBBR122的DNA序列(GenBank??No.?Y14439)設(shè)計(jì)引物：

上游引物PBBR?P1:5'-TTTGGTGTCGACCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGG-3'(序列表中SEQ?ID?NO：10)；含有SalI酶切位點(diǎn)，GTCGAC；

下游引物PBBR?P1：5'-TTAGGTGTCGACTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG-3'?(序列表中SEQ?ID?NO：11)?，含有SalI酶切位點(diǎn)，GTCGAC；

用上述引物擴(kuò)增質(zhì)粒pBBR122中包含其復(fù)制位點(diǎn)及卡那霉素抗性基因在內(nèi)的片段，PCR?擴(kuò)增的參數(shù)為：95℃、2?min,?1個(gè)循環(huán)；94℃、30s,?55℃、30s，?72℃、3?min,?25?個(gè)循環(huán)；72℃、10?min?1個(gè)循環(huán)，純化3.2?kb擴(kuò)增產(chǎn)物,用Sal?I?酶解后，加入連接酶讓其自連，自身連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，并用卡那霉素篩選獲質(zhì)粒pRP(序列表中SEQ?ID?NO：12)，提取質(zhì)粒pRP,經(jīng)SalI酶解后，連接入上述能在大腸桿菌中共表達(dá)pmHas和kfiD基因的pQHK的XhoI?位點(diǎn)，獲得在革蘭氏陰性菌中共表達(dá)pmHas和kfiD來(lái)合成透明質(zhì)酸的表達(dá)載體pHK；

（5）將該重組載體pHK轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中獲得所述的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸的工程大腸桿菌pHK/JM109??CGMCC?NO:3926。