[發(fā)明專利]厚革質(zhì)葉片石蠟切片方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110001004.8
• 申請日: 2011-01-05
• 公開（公告）號: CN102175482A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉育梅;盧昌義
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: G01N1/06
• 分類號: G01N1/06;G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務(wù)所 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種植物石蠟切片方法，特別涉及一種厚革質(zhì)葉片石蠟切片方法。

背景技術(shù)

石蠟切片廣泛用于組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中，主要用于觀察細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并可長期保存。石蠟切片制作程序及環(huán)節(jié)繁多，周期長，每個環(huán)節(jié)都會影響切片質(zhì)量，例如切片制作過程中容易出現(xiàn)切片彎曲、切片裂紋等問題(吳民華、柯湛華.石蠟制片術(shù)中切片過程的常見問題及解決方法[J]海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，12(3)：255)，這些問題雖然可以克服，但是如果出現(xiàn)材料破碎，卻是無法補救，必須重新制作切片。材料破碎的原因追溯到石蠟制作過程的許多步驟，包括脫水(張玉英.制作石蠟切片易出現(xiàn)的問題及改進措施[J].中國科技信息，2007，3(6)：91-92.)、透明、透蠟(陳業(yè)文.制作石蠟組織切片標(biāo)本的體會[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，20(3)：210-211.)、包埋、切片、脫蠟及封片等等，只要其中一個步驟出錯，都可能導(dǎo)致材料破碎(王灶安.植物顯微技術(shù)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1992：15-16.)。其中脫水、透明、透蠟、包埋、脫蠟等步驟涉及試劑濃度、成分比例、浸泡時間等因素，切片、染色及封片等過程涉及實際的技術(shù)問題。厚革質(zhì)葉片由于葉片特別厚，制作過程就會帶來相當(dāng)大的困難。首先，試劑進入組織比較困難，但又不能以單純延長試劑浸泡時間來達到目的，因為浸泡時間過長，會給材料帶來不利的影響，比如二甲苯浸泡時間過長，會造成材料脆性增大，組織易碎。其次，脫水過程也比較不容易，而脫水不徹底也會形成空洞蠟片，所以厚革質(zhì)葉片石蠟切片制作常會出現(xiàn)材料破碎，導(dǎo)致切片制作失敗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的石蠟切片制作方法中存在的上述問題，提供一種厚革質(zhì)葉片石蠟切片方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)將葉片沿主脈兩側(cè)切開，將中央有葉脈的部分再橫切成小段；

在步驟1)中，所述葉片可采用新鮮無病蟲害的成熟葉片；所述將葉片沿主脈兩側(cè)切開，可用單面刀片沿主脈兩側(cè)各5～6mm處切開；所述小段的長度可為5～6mm。

2)將步驟1)所得到的葉片用固定劑固定；

在步驟2)中，所述固定劑可采用萬能固定液(亦稱FAA固定液，配方為70％乙醇90ml、冰醋酸5ml、福爾馬林5ml)；所述固定的時間可至少24h。

3)將步驟2)用固定劑固定的葉片脫水；

在步驟3)中，所述脫水的具體方法可為：以60％乙醇開始，5％遞增，每級3～5h，具體為60％乙醇3～5h→65％乙醇中3～5h→70％乙醇中3～5h→75％乙醇中3～5h→80％乙醇中3～5h→85％乙醇中3～5h→90％乙醇中3～5h→95％乙醇中3～5h→100％乙醇3～5h(第一次)→100％乙醇3～5h(第二次)。

4)用二甲苯和乙醇的不同體積比的溶液作過渡，每級2～4h，具體過程為二甲苯∶100％乙醇為1∶2溶液中浸泡2～4h→二甲苯∶100％乙醇為1∶1溶液中浸泡2～4h→二甲苯∶100％乙醇為2∶1溶液中浸泡2～4h→純二甲苯中浸泡2～4h(第一次)→純二甲苯中浸泡2～4h(第二次)。

5)透蠟和包埋：透蠟采用熔點為52～54℃的軟蠟，按體積比，二甲苯∶石蠟為1∶1溶液于37～40℃恒溫箱中過渡浸蠟48～72h，之后換成純石蠟于60～63℃恒溫箱中浸蠟，期間要換1或2次純石蠟，透蠟后用硫酸紙，3張為一個厚度，折2cm×2cm×3cm大的紙盒，用于包埋；

6)切片后展片，再貼片，然后烤片；

在步驟6)中，所述切片可采用生物切片機切片，切片的厚度可為10～12μm；所述展片可先在25％～35％乙醇過渡，后在水溫為48～55℃中的溫水中展片；所述貼片可直接用乙醇燈外焰輕微烘片；所述烤片可于35～39℃的溫箱內(nèi)烤片24～36h。

7)脫蠟復(fù)水；

在步驟7)中，所述脫蠟復(fù)水的具體方法為：按體積比，100％乙醇∶二甲苯為1∶2溶液中1～2min→100％乙醇∶二甲苯為1∶1溶液中1～2min→100％乙醇∶二甲苯為2∶1溶液中1～2min→100％乙醇1～2min(第一次)→100％乙醇1～2min(第二次)→95％乙醇1～2min→85％乙醇1～2min→70％乙醇1～2min→50％乙醇1～2min。

8)染色后封片。