[發明專利]用于乳糜瀉的乳酸菌

有效

• 申請號: 201080066730.1
• 申請日: 2010-03-12
• 公開（公告）號: CN103097513B
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 阿古斯蒂·蒙特塞拉特·卡雷拉斯;蒙特塞拉特·安德魯·科羅米納斯;丹尼爾·拉蒙·維達爾;薩爾瓦多·赫諾韋斯·馬丁內斯;埃絲特·巴塔列爾·萊瓦
• 申請（專利權）人: 熱爾韋·達諾尼公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K35/747;A61K35/744;A61P1/12;C12R1/225;C12R1/245;C12R1/46
• 代理公司: 隆天知識產權代理有限公司72003
• 代理人: 吳小瑛,任曉華

技術領域

本發明涉及用于治療或預防乳糜瀉(coeliac disease)的乳酸桿菌或鏈球菌。

背景技術

乳糜瀉是一種小腸自身免疫性病癥，發生于始自嬰兒期所有年齡段的遺傳易感人群。乳糜瀉由對麥醇溶蛋白(gliadin)的反應引起，所述麥醇溶蛋白是存在于小麥(和小麥族(Triticeae，例如大麥以及黑麥)的相似蛋白)的谷蛋白中相關的富脯氨酸和谷氨酰胺蛋白家族。當暴露于麥醇溶蛋白時，組織轉谷氨酰胺酶修飾蛋白質，且易患乳糜瀉的受試者的免疫系統與小腸組織反應和交叉反應，導致炎癥反應。之后，炎癥引起絨毛萎縮且干擾包括礦物質和脂溶性維生素的營養素的吸收。乳糜瀉的典型癥狀包括腹脹、嘔吐、腹瀉、體重減輕(或兒童發育障礙)、貧血以及疲乏。免疫系統對于麥醇溶蛋白的最強且最常見的反應是針對長度為33個氨基酸的α2-麥醇溶蛋白片段(本文中表示為SEQ ID NO:1)(Shan et al.2005 J.Proteome Res.4:1732-1741;Moron et al.2008;Am.J.Clin.Nut 87(2):405-14)。

經臨床診斷的乳糜瀉的發病率為0.05-0.27%。然而，來自歐洲、印度、南美、澳大利亞以及美國地區的人群研究顯示兒童的發病率為0.33%-1.06%，成人的發病率為0.18-1.2%。數據表明許多人未被診斷出，僅具有輕度的胃腸不適癥狀。

至今為止，已知的唯一有效治療是終生無谷蛋白飲食。

Siegel等(Siegel M.et al.,2006,Chem Biol 13(6):649-58)揭示了十二指腸中降解α2-麥醇溶蛋白的推定33-mer肽表位的酶組合(脯氨酰內肽酶和大麥谷氨酰胺特異性半胱氨酸內肽酶(EP-B2))。Piper等(Piper et al.,2004,J Pharm Exper.Therap 311:213-219)揭示了脯氨酰內肽酶降解麥醇溶蛋白肽的用途。WO 2007/108763揭示了用于促進乳糜瀉或特應性皮炎的免疫耐受的植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株和鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。WO 2006/097415揭示了一種由于細菌間的互補蛋白水解活性而能夠降解麥醇溶蛋白肽的8種酸面團(sourdough)乳酸菌和雙歧桿菌的混合物，所述麥醇溶蛋白肽例如A-麥醇溶蛋白的片段62-75和表位33-mer肽。從這些乳酸菌和雙歧桿菌獲得的焙烤食品可用于患有乳糜瀉的受試者。WO03/028745揭示了具有能夠降解外啡肽A5(衍生自谷蛋白的5-mer肽)的內肽酶的乳酸菌菌株。這些菌株能夠降低腸病原性肽的濃度。

發明內容

進行體外研究以選擇具有益生菌特性的乳酸菌菌株。選擇了大量屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的菌株在培養上清中能夠降解與乳糜瀉有關的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)的肽酶活性。

之后，對于最初所選的菌株，選擇其在胃腸道存活的能力和上清肽酶活性在胃腸道中的穩定性，即其到達乳糜瀉作用位點(即小腸)且在此仍具有活躍的降解33-mer肽的肽酶活性的能力。

接下來，檢測所選的菌株降解推定與乳糜瀉有關的其他肽的能力，所述肽即來自α-麥醇溶蛋白的20-mer肽QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF(SEQ ID NO:2)和來自A-麥醇溶蛋白的13-mer肽LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:3)。

令人驚訝地，發現33-mer肽在模擬人消化道的條件下被緩慢降解，產生對人消化酶的進一步降解具有完全抗性的18-mer肽降解產物PQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)。該新發現使得能夠通過選擇乳酸菌菌株降解18-mer肽的能力而實現改進的進一步選擇。

最終從大量菌株中選擇了三種單菌株和兩種菌株的混合物。這些菌株對于胃腸道條件具有抗性，產生在胃腸道條件下穩定的高肽酶活性，并且有利地降解與乳糜瀉有關的33-mer、20-mer、13-mer肽且還降解具有抗性18-mer肽。從這些菌株純化負責肽降解的酶，并將其表征、測序，在干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)中，其被鑒定為與延長因子Tu相同的蛋白；在嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)中，其被鑒定為延長因子G。