[發(fā)明專利]篩選促進皮膚屏障功能恢復(fù)的物質(zhì)的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080054887.2
• 申請日: 2010-12-03
• 公開（公告）號: CN102906274A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 日比野利彥;山本真實
• 申請（專利權(quán)）人: 株式會社資生堂
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;A61K8/96;A61Q19/00;G01N33/50;G01N33/53
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 田欣;段承恩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及以胱天蛋白酶（caspase）-14對鞘脂激活蛋白原（prosaposin）的分解為指標(biāo)，篩選促進皮膚屏障功能恢復(fù)的物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

角質(zhì)細(xì)胞由于終末分化，對有害環(huán)境形成被稱為“角質(zhì)層”的保護屏障、角質(zhì)層細(xì)胞間隙的脂類在該保護屏障中發(fā)揮重要的作用。角質(zhì)層細(xì)胞間隙的脂類，在表皮角質(zhì)細(xì)胞中與分化同時生物合成，積累在角質(zhì)小體中。角質(zhì)層細(xì)胞間隙的脂類的主要成分神經(jīng)鞘胺醇，是通過葡糖腦苷脂酶切斷由角質(zhì)小體的胞吐作用釋放到角質(zhì)層細(xì)胞間隙中的葡糖神經(jīng)鞘胺醇的糖鏈而生成的。此外，已知在其他途徑中，由鞘磷脂酶將鞘髓磷脂分解為神經(jīng)鞘胺醇。

作為鞘脂類活化蛋白質(zhì)的鞘脂激活蛋白（saposin）是水解鞘脂類必需的蛋白質(zhì)，已知存在4種鞘脂激活蛋白（鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白D）。由于鞘脂激活蛋白是作為產(chǎn)生角質(zhì)層細(xì)胞間隙脂類必需的神經(jīng)鞘胺醇合成酶（例如葡糖腦苷脂酶、鞘磷脂酶等）的輔酶作用的因子，所以認(rèn)為鞘脂激活蛋白對皮膚屏障功能而言是重要的。

迄今為止，已確認(rèn)鞘脂激活蛋白A、C、D如果在內(nèi)臟中積累，則產(chǎn)生溶酶體貯積癥（例如，Gaucher氏病、Niemann-Pick病），鞘脂激活蛋白原（prosaposin）基因的突變造成神經(jīng)損傷性的表型。已報道了在患有與皮膚相關(guān)的特應(yīng)性皮炎或牛皮癬的患者中，鞘脂激活蛋白原降低（分別參見Tezuka等人，Journal?of?Investigative?Dermatology(1997)109,319-323和Alessandrini等人，Journal?of?Investigative?Dermatology(2001)116,394-400）。

已知在各種皮膚疾病（例如特應(yīng)性皮炎、牛皮癬、接觸性皮炎等）中可見的皮膚粗糙癥狀中，水分從皮膚的喪失比健康皮膚更旺盛。所謂的水分透皮蒸發(fā)量（TEWL）的增加可以認(rèn)為與承擔(dān)保持皮膚內(nèi)的水分或作為屏障功能的成分減少相關(guān)。

迄今為止，已報道了伴隨著皮膚屏障功能降低，皮膚的皮膚功能降低，其結(jié)果是出現(xiàn)皮膚增殖性異常的情況。特別是在高齡對象的情況下，由于恢復(fù)已降低的皮膚屏障功能花費長的時間，因而需要新型皮膚屏障功能恢復(fù)劑，所述新型皮膚屏障功能恢復(fù)劑對于阻止隨年齡增加而導(dǎo)致皮膚的皮膚功能降低所造成的皮膚增殖性異常等有效。

對所研究的包括促進皮膚屏障功能恢復(fù)的制劑等化妝品在內(nèi)的物質(zhì)，必須在動物實驗中確認(rèn)其效果。然而，近年來，在化妝品研發(fā)的實際情況中，具有出于倫理的觀點限制動物實驗的傾向，對不用動物而篩選候選物質(zhì)的方法需求變高。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Tezuka等人，Journal?of?Investigative?Dermatology(1997)109,319-323

非專利文獻(xiàn)2：Alessandrini等人，Journal?of?Investigative?Dermatology(2001)116,394-400

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明要解決的課題

本發(fā)明的課題是提供使用新型指標(biāo)的恢復(fù)皮膚屏障功能的物質(zhì)的篩選方法。

解決課題的手段

胱天蛋白酶（caspase）-14是胱天蛋白酶（caspase）家族的最新成員，主要在分化的角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。胱天蛋白酶-14鑒定出了胱天蛋白酶家族成員間相同的EST。根據(jù)最近的研究顯示，角質(zhì)化細(xì)胞中的胱天蛋白酶-14加工變成異二聚體，之后表現(xiàn)出對與胱天蛋酶-1對應(yīng)的合成底物Trp-Glu-His-Asp-AFC的酶的活性（Mikolajczyk?J.等人，Biochemistry?43,10560-9(2004)）。這一水解活性對蛋白質(zhì)分解切割和親液鹽的存在是必需的。胱天蛋白酶-14的一級結(jié)構(gòu)與炎性胱天蛋白酶（例如胱天蛋白酶（caspase）-1、-4和-5）非常相似，但胱天蛋白酶（caspase）-14僅限于分化的角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，提示與角質(zhì)細(xì)胞終末分化中的其他形態(tài)相關(guān)（Lippens?S.等人，Cell?Death?Differ.7,1218-24(2000)）。然而，尚未了解胱天蛋白酶-14的活化機制、天然底物或調(diào)節(jié)因子。

在本文中，本發(fā)明人從分化的培養(yǎng)人表皮角質(zhì)化細(xì)胞（NHEK）提取物中分離與胱天蛋白酶-14結(jié)合的蛋白質(zhì)，進行LC/MS/MS分析，從結(jié)合胱天蛋白酶-14的蛋白質(zhì)中鑒別出鞘脂激活蛋白原（prosaposin）。