[發明專利]具有提高的生產丁醇能力的重組微生物和使用其生產丁醇的方法

有效

• 申請號: 201080052858.2
• 申請日: 2010-09-21
• 公開（公告）號: CN102666839A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 李相燁;張維新;李真英;李鐘民;樸軫煥
• 申請（專利權）人: 韓國科學技術院;生物普爾肯株式會社;GS加德士公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/16;C12N15/52
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 徐金國

技術領域

本發明涉及具有提高的生產丁醇能力的重組微生物，和使用其生產丁醇的方法。更具體來說，本發明涉及生產丁醇的能力通過操縱它們的代謝網絡而提高的重組微生物和使用其生產丁醇的方法。

背景技術

近來油價上升引發了對替代燃料如生物燃料的越來越多的興趣。而且，對具有比乙醇更優異的物理性質的汽油替代品-丁醇有越來越多的興趣，因此對生產溶劑如丁醇作為代謝產物的梭菌種(Clostridium?sp.)菌株也有越來越多的興趣。

已知梭菌種的微生物是革蘭氏陽性、嚴格厭氧的形成芽孢的細菌，并且主要產生乙酸和丁酸作為發酵產物。其中，一些菌株引發丙酮-丁醇-乙醇發酵(下文稱作ABE發酵)，該發酵除上述有機酸外還產生丙酮、丁醇和乙醇。

實際上，在20世紀早期，作為這樣的菌株之一的丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)被用于大量地生產丙酮和丁醇。這種大規模生產持續到1960年代和1970年代，但除了在一些國家外，這種生產都中斷了，因為由原油產生的丙酮和丁醇由于化學工藝的發展而變得廉價，以及難以供應底物。

至今仍利用梭菌種菌株進行的生物丁醇生產產生以下問題。首先，與基于酵母的生物乙醇生產相比，其表現出顯著低的收率和生產效率。其次，梭菌種菌株除產生作為生物燃料的非常有價值的丁醇外，還產生副產物，包括丙酮、乙酸和丁酸，這提高了它們的分離成本。

在產生溶劑的梭菌種菌株中，如同一般的微生物發酵，有機酸的產生在指數生長期發生。這個階段被稱為產酸階段。隨著靜止期到來，細胞代謝轉變為產溶劑階段，在此階段有機酸被再吸收并且產生溶劑如丙酮(或異丙醇)、丁醇和乙醇。這可以解釋如下。隨著靜止期到來，pH值降低，因此未解離有機酸的濃度增加。在這些酸中，未解離的丁酸表現出高細胞毒性。通過有機酸的這一再吸收以及轉化為溶劑，細胞獲得時間而形成可以在嚴酷環境下長期存活的芽孢。

在野生型菌株中，發酵后以約為3:6:1的質量比產生丙酮、丁醇和乙醇，并且還產生痕量的乙酸、丁酸和乙偶姻。已知葡萄糖用作底物時，在最終濃度約10g/L時以約為20-25%的質量收率生產丁醇(Lee等人，Biotechnol.Bioeng.，101(2):209-228，2008)。當采用這種野生型菌株生產丁醇時，存在產量及產率低以及難于從其它代謝產物中分離出丁醇的問題，因此增加了生產成本。

為此，近年來，致力于基于基因工程知識和工具，利用按需操縱代謝路徑的代謝工程途徑來制作改進的菌株。對于丙醇丁醇梭菌，其產生代謝產物的路徑已長期為人所知，并且其基因組已被測序，且其相應的基因被全部鑒定(Nolling等人，J.Bacteriol.2001)。

丁醇生產中問題最大的代謝物是丙酮。如果使用氣提進行溶劑分離，那么丙酮和丁醇作為混合物被分離，因為不像有機酸，它們都容易蒸發，因此需要額外的分離過程。乙酰乙酰-CoA通過CoA移轉酶和乙酰乙酸脫羧酶轉化成丙酮。這些酶分別由基因ctfAB和adc表達。所以，通過刪除一種或多種這些基因，丙酮在溶劑中的濃度可以被降低。根據最近的報道，發現刪除adc可以降低丙酮濃度，確實可以降低丙酮比例(Jiang等人，Metab.Eng.，11(4-5):284-291，2009)。

而且，在梭菌種的情況下，有這樣的例子，其中通過單交換插入質粒刪除表達磷酸轉乙酰酶的基因pta(磷酸轉乙酰酶為乙酸生產路徑的酶)和表達丁酸激酶的基因buk(Green等人，Microbiology.142:2079-2086，1996)。但是，有報道，當刪除編碼丁酸激酶的基因buk時，丁醇濃度增加至約16g/l，但是當刪除編碼磷酸轉乙酰酶的pta基因時，丁醇的濃度為9.9g/l，表明丁醇的濃度和丁醇的選擇性沒有實質的增長。

WO2008/052973公開了其中丁酸生產路徑和乙酸生產路徑被阻斷的菌株，以及其中丁酸生產路徑、丙酮生產路徑和乙酸生產路徑被阻斷的菌株。但是，必須阻斷丁酸生產路徑，因此，當僅刪除乙酸生產路徑時，無法確定產生丁醇的能力是否增加。另外，WO2008/052973公開了基于buk或ptb的刪除的各種基因組合的刪除，但其實例示出的僅為通過刪除buk基因獲得的已知的結果，并且該專利文件公開了涉及刪除各種基因組合的實例。換言之，該專利文件總體上僅提出了基于buk或ptb刪除的可能的各種基因組合的刪除，并沒有提供科學實驗基礎，但這不可能確定這些刪除能否有助于實際丁醇生產中濃度、收率、選擇性等的提高。