[發(fā)明專利]治療性觸角足-抗體分子及其使用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080026328.0
• 申請日: 2010-04-14
• 公開（公告）號: CN102459329A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: A·埃佩內(nèi)托斯;C·庫斯帕魯
• 申請（專利權(quán)）人: 特洛伊科技有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K16/44;C07K19/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民;陸惠中

發(fā)明背景

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及分子向細(xì)胞的遞送，更具體而言，本發(fā)明涉及含有觸角足(Antp)或Antp片段的治療性抗體-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物(啜合物，conjugate)。

背景信息

觸角足(Antp)基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，其已被證明控制果蠅屬(Drosophila)胚中的前后形態(tài)發(fā)生。觸角足的蛋白質(zhì)序列以存在與特異性DNA靶元件結(jié)合的60個氨基酸基序(同源域)為表征。已經(jīng)在幾乎所有的多細(xì)胞生物體中發(fā)現(xiàn)了觸角足同源染色體，它們顯示很高程度的氨基酸序列同一性。人類和果蠅屬觸角足蛋白在同源域序列中的差異僅在于一個保守的氨基酸替代。

經(jīng)觀察，觸角足及其同源域能夠易位跨過哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜。易位并不取決于細(xì)胞胞吞作用，據(jù)報道，易位在4℃和37℃下發(fā)生。由D氨基酸組成的同源域合成肽也能夠跨過細(xì)胞質(zhì)膜。這種發(fā)現(xiàn)將排除Antp通過受體介導(dǎo)的機制而易位的可能性。該特性已被用來將小的病毒序列運載入(vehiculate)到培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，以及被用來引起針對流感病毒的核蛋白的MHCI類限制性細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答。然而，到目前為止，Antp的同源域僅被用來輸送小的合成肽。

堿性肽，如果蠅屬觸角足或HIV-1的Tat，可促進連接的肽和擬肽(peptidomimetic)分子的細(xì)胞內(nèi)化。平截的HIV-1?Tat蛋白堿性結(jié)構(gòu)域通過質(zhì)膜迅速易位并在細(xì)胞核中積聚。具有細(xì)胞穿透特性的非天然堿性肽也已經(jīng)被合成。這些肽被統(tǒng)稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)。已經(jīng)注意到與PTD結(jié)合的肽、反義寡核苷酸和蛋白質(zhì)有效地內(nèi)化，并且，已經(jīng)在幾種細(xì)胞和動物模型中檢測到它們的生物學(xué)作用。這種生物學(xué)活性大分子細(xì)胞內(nèi)遞送的非侵入途徑可能是非常有效的策略，因為可以直接攻擊(attack)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)靶。

抗體及其重組片段的高度特異性和長效半衰期使它們成為選擇性靶向劑的優(yōu)秀候選者。單鏈可變區(qū)片段(Single?chain?fragment?variable)(scFv)和單克隆抗體(mAbs)能夠采用有功能的三維構(gòu)象，其將VH和VL結(jié)構(gòu)域連接在一起。標(biāo)準(zhǔn)IgG抗體的分子量為150,000Da，scFv抗體的分子量為30,000Da，因此，內(nèi)化整個IgG以及小的scFv分子是潛在可行地。利用重組DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)可有效獲得細(xì)胞中的單鏈mAb表達，然而，靶細(xì)胞對DNA構(gòu)建物的通常較低的接近性以及對抗體水平的藥理學(xué)調(diào)節(jié)的缺乏給治療應(yīng)用前景造成限制。

發(fā)明概述

本發(fā)明基于這樣一個基本發(fā)現(xiàn)：即，與觸角足結(jié)合的抗體或其片段是有效的治療劑。本發(fā)明描述了在觸角足羧基或氨基末端與其重組融合或化學(xué)偶聯(lián)的抗體或抗體片段的構(gòu)建(“貨物-運載體”構(gòu)建物)。令人驚奇地，Antp能夠輸送作為大的復(fù)雜分子的抗體。

能夠穿透細(xì)胞膜的觸角足-抗體或抗體片段偶聯(lián)物或構(gòu)建物顯著擴大了創(chuàng)新治療劑的潛能。用共聚焦顯微鏡在完整的人類培養(yǎng)的細(xì)胞中觀察到熒光素抗體-Antp構(gòu)建物的內(nèi)化(參見實施例)。在培養(yǎng)基中溫育幾個小時之后，在單個細(xì)胞中測定細(xì)胞質(zhì)和核區(qū)室的熒光強度。相對于胞外培養(yǎng)基濃度，細(xì)胞質(zhì)、胞核和多個核仁中構(gòu)建物的濃度水平實質(zhì)上更高。通過在細(xì)胞中引入重組載體或蛋白質(zhì)而使基因功能沉默已是細(xì)胞生物學(xué)的主要目標(biāo)，該目標(biāo)最初通過各種侵入性技術(shù)，如顯微注射、紅細(xì)胞影融合(red?cell?ghost?fusion)或電穿孔來實現(xiàn)。本發(fā)明提供用于遞送到細(xì)胞的核酸構(gòu)建物和蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。

如本文所述的，使PTD與IgG和scFv抗體融合允許產(chǎn)生能有效抑制細(xì)胞內(nèi)靶的功能的“細(xì)胞穿透”抗體。這些特征使本發(fā)明的分子從治療前景來看更有效。

Antp的同源域可被用于易位抗體——包括其片段(例如，scAb)。本發(fā)明的一個關(guān)鍵益處是Antp同源域可被用于將功能和調(diào)節(jié)抗體易位到細(xì)胞。

附圖簡介

圖1顯示熒光素抗體到細(xì)胞的輸送。圖1A-人胚腎(293)細(xì)胞；圖1B-人類前列腺癌(PC3)細(xì)胞。

發(fā)明詳述

本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)：即，Antp的同源域可被用于將抗體或其片段輸送到細(xì)胞中，其比現(xiàn)有的遞送工具更有效。這樣的融合蛋白或偶聯(lián)物提供有效的調(diào)節(jié)或治療組合物。