[發(fā)明專利]識(shí)別基因型的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080014225.2
• 申請(qǐng)日: 2010-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN102369297A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 山根明男;中山尚母;北野史朗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 凸版印刷株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/09;G01N21/78;G01N33/50;G01N33/566
• 代理公司: 隆天國際知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 72003
• 代理人: 崔香丹;洪燕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因多態(tài)性或體細(xì)胞突變等基因型的識(shí)別方法以及該方法中所用的試劑盒，更詳細(xì)而言，涉及一種改善以利用了鏈置換反應(yīng)的競(jìng)爭性雜交來識(shí)別核酸堿基序列微小差異的方法的識(shí)別精度的方法，以及該方法中所用的試劑盒。

本申請(qǐng)是基于2009年3月31日在日本提出的“特愿2009-084967號(hào)”要求優(yōu)先權(quán)，并在此將其內(nèi)容援引到本申請(qǐng)中。

背景技術(shù)

通過人類基因組的解讀、尤其是通過制作SNP(Single?Nucleotide?Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)圖譜的國際人類基因組單體型圖計(jì)劃，有關(guān)人類基因組的信息日趨增加。并且，在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)大規(guī)模開展以實(shí)現(xiàn)下述“對(duì)應(yīng)于個(gè)人遺傳信息的醫(yī)療”(量身定制式醫(yī)療)作為目標(biāo)的研究：通過發(fā)現(xiàn)所獲得的基因組信息與個(gè)人體質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，掌握基因水平上的個(gè)人體質(zhì)差別，可對(duì)應(yīng)于個(gè)人特性進(jìn)行疾病診斷、治療、預(yù)防或施藥。這里的基因差別，意指每個(gè)人的基因組堿基序列上的差別，其主要差別是單核苷酸的差別(SNP(單核苷酸多態(tài)性))。另外，最近，已了解短堿基序列的重復(fù)次數(shù)(拷貝數(shù))的差別(拷貝數(shù)變異(Copy?Number?Variation，CNV))也廣泛存在于全基因組中，并指出了該CNV的差別與疾病之間的關(guān)聯(lián)性。

在此，為了掌握個(gè)人在基因水平上的差別，有必要調(diào)查每個(gè)人的基因型。例如，已知在某SNP中，其基因型為AA、AG、GG三種。A表示腺嘌呤、G表示鳥嘌呤堿基，該SNP是基因組位置有腺嘌呤時(shí)和鳥嘌呤時(shí)的一個(gè)例子。因此，為識(shí)別該SNP的基因型的檢查，就是要確定是該三種基因型中的哪一種。即，只要發(fā)現(xiàn)A是0和100中的哪一個(gè)、G是0和100中的哪一個(gè)或者A和G是否為50和50即可。如此，SNP等生殖細(xì)胞突變的檢測(cè)，基本可以說是定性的檢測(cè)，該方法中較容易的、簡便的各種方法得到實(shí)用化。

另一方面，在癌細(xì)胞中，在體細(xì)胞水平上發(fā)生突變并且該突變成為癌的誘因而與異常增殖有關(guān)。因此，在某特定種類的癌細(xì)胞中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)特定基因的突變，可以將該突變作為指標(biāo)進(jìn)行癌細(xì)胞的檢測(cè)。但是，癌細(xì)胞富有多樣性，根據(jù)一種突變來確定癌細(xì)胞則未必容易。

另外，在最近的藥物療法中，開發(fā)了以生物體內(nèi)特定的分子(蛋白質(zhì)等)作為目標(biāo)的藥劑，且發(fā)現(xiàn)了副作用少、效果高的藥劑。它們被稱作分子靶向藥物，主要在癌治療領(lǐng)域中得到積極的開發(fā)。最近，明確了在這些分子靶向藥物中，當(dāng)作為靶標(biāo)的分子的信號(hào)傳遞的下游蛋白質(zhì)中發(fā)生突變時(shí)，則該藥劑的效果得不到發(fā)揮等。此時(shí)，通過調(diào)查對(duì)發(fā)生有突變的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因的突變，可以預(yù)測(cè)該藥劑的效果，不斷開拓與SNP檢測(cè)不同的新型“量身定制式醫(yī)療”的領(lǐng)域。

在此所述的癌細(xì)胞中的特征性突變或者對(duì)分子靶向藥物顯示抵抗性的突變，幾乎都是體細(xì)胞突變。在前述的生殖細(xì)胞突變時(shí)在所有細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)相同的突變，與此相對(duì)，在體細(xì)胞突變中只在引起突變的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)突變，在未引起突變的細(xì)胞(通常為正常細(xì)胞)中未發(fā)現(xiàn)突變。因此，通常在標(biāo)本(作為檢查對(duì)象的試樣)中處于突變細(xì)胞和正常細(xì)胞相混合的狀態(tài)，對(duì)應(yīng)于這些細(xì)胞的豐度比(abundance?ratio)，存在有突變基因和正常基因。即，若試樣的大部分是正常細(xì)胞而含有部分突變細(xì)胞，則不得不從大量正常基因中檢測(cè)出所存在的少許突變基因，而這就是與生殖細(xì)胞中的突變檢測(cè)的不同點(diǎn)，使體細(xì)胞的基因變異檢測(cè)變得更加困難。

在體細(xì)胞的基因變異檢測(cè)法中，大致分為兩種方法。其中，一種是在基因擴(kuò)增階段區(qū)別正常基因和突變基因的方法，具體而言，只對(duì)突變基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增的方法。

例如，作為靈敏度最好的方法，是用限制酶只對(duì)正常基因進(jìn)行切割并只對(duì)未切割的突變基因進(jìn)行擴(kuò)增的、被稱作“mutant-enriched?PCR(突變體富集PCR)”的方法(例如，參照非專利文獻(xiàn)1)。在該方法中，通過反復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增突變基因的反應(yīng)，可以從正常基因10⁶分子中檢測(cè)出1分子的突變基因(例如，參照非專利文獻(xiàn)2)。該方法在這種所謂高靈敏度的方面優(yōu)良，但操作非常繁雜，并不是可以適用于通常的診斷中的方法。