[發(fā)明專利]基于siRNA的細(xì)胞特異性有效的分子和用于制備其的應(yīng)用試劑盒及其用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080011796.0
• 申請(qǐng)日: 2010-03-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102348799A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: T·珀?duì)柭?/a>;D·伊姆霍夫;S·克恩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 耶拿市弗里德里希·席勒大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/113
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 林曉紅

背景技術(shù)

本發(fā)明涉及基于“短干擾RNA”(siRNA)的特異性生物學(xué)有效分子。當(dāng)激活后，所述生物學(xué)有效分子與靶基因的RNA相互作用，并與特定的內(nèi)切核糖核酸酶形成稱為“RISC”(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)的RNA蛋白復(fù)合物。RISC復(fù)合物結(jié)合靶mRNA，并且內(nèi)切核酸酶切割靶mRNA。以這種方式抑制了基因表達(dá)，并由此防止形成靶蛋白。

可以使用能夠細(xì)胞特異性激活的生物學(xué)有效分子在例如衰老特異性治療中等來(lái)防止異常細(xì)胞并抑制它們的生長(zhǎng)，特別是治療腫瘤和病毒感染。通常，能夠細(xì)胞特異性激活的生物學(xué)有效分子可以用于調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的基因表達(dá)。但是通過(guò)生物學(xué)活性分子，其不僅可以降低基因的表達(dá)，還可以通過(guò)降低靶基因的負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)增加基因表達(dá)。

已經(jīng)描述了在真核細(xì)胞中通過(guò)引入短(19-23bp)雙鏈RNA分子(siRNA)來(lái)抑制基因表達(dá)，該RNA分子對(duì)靶基因的mRNA序列片段是特異性的：Elbashir?SM?et?al.：Duplexes?of?21-nucleotide?RNAs?mediate?RNA?interference?in?cultured?mammalian?cells，Nature，2001?May?24，411(6836)，494-8；Liu?Y?et?al.：Efficient?and?isoform-selective?inhibition?of?cellular?gene?expression?by?peptide?nucleic?acids，Biochemistry，2004?Feb.24，43(7)，1921-7；US?5,898,031；US?7,056,704)。

此類分子并不抑制基因的閱讀和mRNA的產(chǎn)生，但是siRNA引發(fā)破壞靶mRNA的細(xì)胞自身的機(jī)制。最后，抑制了特定蛋白的形成而不破壞其他基因的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄后基因沉默)。

為了抑制基因的表達(dá)，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑和電穿孔將siRNA直接引入細(xì)胞。(Zhang?M?et?al.：Downregulation?enhanced?green?fluorescence?protein?gene?expression?by?RNA?interference?in?mammalian?cells，RNA?Biol.2004?May，1(1)，74-7；Gilmore?IR?et?al.：Delivery?strategies?for?siRNA-mediated?gene?silencing，Epub?2004?May?22.，Curr?Drug?Deliv.2006?Apr.，3(2)，147-5；US?6,506,559)。

這種方法的劣勢(shì)在于siRNA較不穩(wěn)定，但是這可以通過(guò)化學(xué)修飾而加以改善(US?6,107,094)。

生物學(xué)有效分子的治療應(yīng)用中的一個(gè)特殊問(wèn)題是體內(nèi)應(yīng)用。對(duì)于此類應(yīng)用已經(jīng)提出了方法來(lái)穩(wěn)定siRNA以減少分解(Morrissey?et.al.：Chemical?Modifications?of?Synthetic?siRNA，Pharmaceutical?Discovery，May?1，2005)，并且還開(kāi)發(fā)了諸如納米顆粒體內(nèi)-jetPEITM(Polyplus)的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)在體內(nèi)將siRNA引入細(xì)胞(Vernejoul?et?al.：Antitumor?effect?of?in?vivo?somatostatin?receptor?subtype?2?gene?transfer?in?primary?and?metastatic?pancreatic?cancer?models，Cancer?Research?62，2002，6124-31；Urban-Klein?B，Werth?S，Abuharbeid?S，Czubayko?F，Aigner?A：RNAi-mediated?gene-targeting?through?systemic?application?of?polyethylenimine(PEI)-complexed?siRNA?in?vivo，Gene?Ther?12(5)，2005，461-6.).

而且，還開(kāi)發(fā)了方法來(lái)在體內(nèi)增加靶細(xì)胞的siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染(Ikeda?et.al.：Ligand-Targeted?Delivery?of?Therapeutic?siRNA，Pharmaceutical?Research，Vol.23，No.8，August?2006)。