[發明專利]測定去抑制后酶活性的方法和設備

有效

• 申請號: 201080004429.8
• 申請日: 2010-01-08
• 公開（公告）號: CN102272596A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: H·W·霍夫;H·J·邁耶
• 申請（專利權）人: 帕普斯特許可有限兩合公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶家蓉

本發明涉及測定去抑制后的酶活性，具體是測定蛋白水解酶，主要是測定在惡性腫瘤診斷和治療中至關重要的半胱氨酸蛋白酶活性的方法和設備。

樣品中存在酶與抑制物的復合物，在體內蛋白水解酶的活性主要通過與抑制物結合而受到抑制。類似的論題可參見WO97/00969中所述。

另外，德國專利申請10?2007?017?681.5涉及類似的發明，還有德國專利申請10?2007?057?388.1和10?2007?034?120.7，它們所公開的全部內容通過引用納入本文。

根據現有技術，已知此類酶活性的測定主要受到樣品中抑制物的抑制，酶活性的測定方法是，先使樣品通過柱流穿，除去樣品中抑制該酶的抑制物。然后，將無抑制物的酶加到檢測容器中，加入合適的底物后，通過反應期間至少一種酶切產物濃度的提高來測定該酶的活性。

本專利申請的目的是提供測定去抑制后酶活性的方法和設備，實現了檢測靈敏度的顯著提高和更高的可靠性，這樣就不再需要為獲得生物樣品而進行手術干預，因為現在可用血清替代生物樣品。

另外，本發明提供的測定去抑制后酶活性的方法和設備，適合執業醫師或小規模醫學實驗室的每日日常工作，或急診病例，其操作相當簡便，能提供足夠準確的結果，特別是費用低而有效，可作為預后要素(決定療法)或作為預后指標(診斷目的)。

采用權利要求1所述的測定去抑制后酶活性的方法和權利要求10所述的測定去抑制后酶活性的設備可實現該目的。

其它實施方式和其它添加內容出自從屬權利要求。

為了測定去抑制后的酶活性，優選熒光底物其中7-氨基-4-甲基香豆素，作為熒光物質與寡肽，優選二肽的C-末端結合，其N-端用羧基芐基保護基團保護(縮寫為Cbz或Z)。

然而，某些情況下，明確地說，測定結果不夠準確。

C-末端用7-氨基-4-三氟甲基香豆素代替7-氨基-4-甲基香豆素，可使切下的熒光物質的發射光遷移到更長的波長，從而可在該波長范圍內檢測酶切下的熒光物質的熒光，而樣品中其它要檢測的發光物質不會再干擾其測定結果，從而實現靈敏度更高的酶活性檢測，特別是用普通設備和方法時。

如果生物樣品是(例如)組織樣品或組織勻漿，采用旁路法，可檢測樣品通過旁路后樣品中原先不受抑制的半胱氨酸蛋白酶的那部分酶活性。已知組織勻漿中要測定的是受抑制的蛋白酶而不是所有酶，這只是其中的一部分酶。因此，測定兩次酶活性，即生物樣品通過親和層析柱后和通過旁路后兩次測定值的差異，提供了生物樣品中原先受抑制的酶活性。

本發明所測定的發射熒光的波長范圍約為500nm至以上。

以下附圖顯示：

圖1顯示本發明第一個實施方式測定去抑制后酶活性所用的設備。

圖2顯示與圖1設備相比功能改進的設備，它幾乎是半自動化設備。

圖3顯示本發明另一個實施方式測定去抑制后酶活性所用的設備。

在圖1和圖2中，模塊A為平面剖視圖，模塊B為立體圖。

在附圖描述中，對于相同或功能相同的部件采用相同的數字。

圖1顯示本發明第一個實施方式測定去抑制后酶活性所用的設備。

可替換親和層析柱1包封在配備至少一個珀耳帖(Peltier)元件的恒溫器2內。柱1是圓柱體，充填有多孔基質凝膠載體，該載體基質結合酶抑制物復合物中的抑制物比酶更牢固。因此，酶被釋放，可測定其活性。可替換注射器4的尖端8可伸入柱1的上部開口3內，優選在柱1的下端安裝關閉閥門6，注射器4內裝入體積5含酶與抑制物復合物的樣品。

當垂直推壓注射器4時，體積5實際變為0，內含物進入裝有載體(優選緊密裝填)的柱1中。

然后用第二注射器7將體積為樣品體積約100-103倍的洗脫緩沖液全部或部分加入柱1中。

第一種方法如下：取樣品與一部分洗脫緩沖液一起在柱1中，于確定的適當溫度(例如約4℃)下培育一段時間，具體約10-18分鐘。15分鐘特別有效。然后，用注射器7進一步加入洗脫緩沖液，洗脫游離的酶，當打開閥門6時，洗脫液向下流入圖1的模塊B中。

在第一種方法中，先打開閥門6直到一部分柱緩沖液進入柱1內，或直到樣品分散到整個柱長內。此時，可不考慮計量排放(例如圖2所述，通過排水管28)體積。培育后，打開閥門6進行洗脫，然后關閉閥門，殘留體積不會損害測量值。該殘留體積也可通過排水管28排放。