[發明專利]用于鑒定細胞表面抗原的免疫結合劑的方法

有效

• 申請號: 201080003451.0
• 申請日: 2010-02-22
• 公開（公告）號: CN102239181A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發明（設計）人: V·胡爾曼-考提爾;D·厄里什
• 申請（專利權）人: 艾斯巴技術;愛爾康生物醫藥研究裝置有限責任公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N5/0781;C12N15/13;G01N33/537
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

背景信息

免疫結合劑，包括抗體、其綴合物和衍生物，作為治療劑和診斷劑在商業上是極其重要的。用于抗體制備或篩選的常規方法通常利用可溶性抗原。然而，對于某些膜結合的蛋白抗原，如果從膜上溶解抗原將改變抗原上的構象表位，從而導致抗體制備或篩選的失敗。此外，免疫印跡和親和層析法中的一個主要問題是將選擇具有對抗原的中等親和力的抗體。這允許包含許多交叉反應性或粘性抗體(sticky?antibody)，從而在連續篩選方法中造成負擔。雖然已將表達膜結合抗原的細胞直接用于抗體制備，但仍然缺乏能夠檢測和富集高親和力的抗細胞表面抗原的抗體的高效篩選方法。

發明概述

本發明提供了用于鑒定能夠特異性結合細胞表面抗原的免疫結合劑例如scFv抗體的方法。本發明的方法通常包括將標記的表達抗原的細胞與標記的表達免疫結合劑的細胞接觸，然后使用細胞分選儀分離結合表達抗原的細胞的表達免疫結合劑的細胞。此類方法對于快速且高效地鑒定抗存在于膜內在蛋白(integral?membrane?protein)例如GPCR中的構象表位的免疫結合劑是特別有用的。本發明還提供了使用本發明的方法鑒定的分離的免疫結合劑和編碼免疫結合劑的核酸。

在一個方面，本發明提供了用于鑒定特異性結合目的細胞表面抗原的免疫結合劑的方法。該方法包括：提供多個可操作地連接第一可分選標記的表達免疫結合劑的細胞；提供多個可操作地連接至第二可分選標記的表達抗原的細胞，其中目的抗原展示在表達抗原的細胞的表面；將表達抗原的細胞與表達免疫結合劑的細胞接觸；和使用細胞分選器(例如，熒光激活細胞分選器)從多個表達免疫結合劑的細胞分離一個或多個可特異性結合表達抗原的細胞的表達免疫結合劑的細胞，其中單個細胞復合物(例如，抗原與B細胞受體之間形成的復合物)中第一和第二可分選標記的存在標示著表達免疫結合劑的細胞與表達抗原的細胞的結合，從而鑒定了結合目的抗原的免疫結合劑。

在一些實施方案中，克隆性地分離分離的表達免疫結合劑的細胞。在一些實施方案中，將表達免疫結合劑的細胞經歷克隆擴增(clonal?expansion)。在其他實施方案中，從表達免疫結合劑的細胞分離編碼免疫結合劑的核酸序列。用于分離編碼免疫結合劑的核酸序列的適當方法包PCR，例如單細胞PCR。可在克隆性分離細胞后和/或克隆擴增后分離編碼免疫結合劑的核酸序列。

在一些實施方案中，將使用本發明的方法分離的表達免疫結合劑的細胞經歷基于細胞的測定以在功能上表征免疫結合劑。適當的基于細胞的測定包括CELISA。

在一些實施方案中，免疫結合劑是抗體。此類抗體包括小鼠抗體、兔子抗體、兔源化(rabbitized)抗體、雞抗體、駱駝抗體、駱駝源化(camelized)抗體、人抗體、人源化抗體和嵌合抗體。適當的抗體形式包括但不限于Fab、Dab、納米抗體(Nanobody)和scFv。

在一些實施方案中，從外源基因表達目的抗原。在其他實施方案中，目的抗原是經遺傳工程改造的抗原。在其他實施方案中，目的抗原是膜內在蛋白。適當的膜內在蛋白包括但不限于GPCR(例如，CXCR2)或離子通道。

在一些實施方案中，第一或第二可分選標記是熒光標記。適當的熒光標記包括但不限于熒光蛋白質、抗體/熒光綴合物(fluor?conjugate)和熒光細胞標記。

在一些實施方案中，表達抗原的細胞是酵母或哺乳動物細胞(例如，人細胞)。在一些實施方案中，表達抗原的細胞表達外源抗原。在一些實施方案中，用表達載體轉染表達抗原的細胞。

在一些實施方案中，表達免疫結合劑的細胞是酵母或哺乳動物細胞。適當的哺乳動物細胞包括但不限于B細胞，例如兔B細胞。在一些實施方案中，從經免疫的動物例如通過DNA接種免疫的動物分離B細胞。在一些實施方案中，表達免疫結合劑的細胞包含從表達載體表達的免疫結合劑。

在另一個方面中，本發明提供了編碼通過本發明的方法鑒定的免疫結合劑的分離的核酸分子。

在另一個方面中，本發明提供了產生能夠結合目的抗原的免疫結合劑的方法，其包括將通過本發明的方法鑒定的編碼免疫結合劑的核酸序列引入表達環境以便產生編碼的免疫結合劑。

在另一個方面中，本發明提供了由本發明的方法產生的免疫結合劑。