[發明專利]一種制備谷氨酸脫羧酶的方法

有效

• 申請號: 201310244021.3
• 申請日: 2013-06-19
• 公開（公告）號: CN103305495A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 董永勝
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種制備谷氨酸脫羧酶的方法，特別涉及利用反膠團萃取技術制備谷氨酸脫羧酶的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

谷氨酸脫羧酶（Glutamate?decarboxylase，GAD）是一種吡哆醛類裂解酶，廣泛存在于植物、動物和微生物中。谷氨酸脫羧酶是生物催化L-谷氨酸或其鈉鹽上的α-羧基進行脫羧反應生成γ-氨基丁酸和CO₂的唯一酶，它還極可能作為特定的診斷酶來預測和區分糖尿病以及作為極具潛力的診療型酶制劑。

谷氨酸脫羧酶所催化產生的γ-氨基丁酸具有降血壓、增進腦活力、營養神經細胞、保持神經安定、促進生長激素分泌和保肝利腎等多種生理功能，在醫藥和保健食品中具有廣泛的應用價值，已被我國衛生部列為“新資源食品”。因此，GAD用于醫療和食品具有很大的潛力。利用游離或固定化谷氨酸脫羧酶進行γ-氨基丁酸的生物制備日益得到重視，與細胞催化相比，可以避免細胞自身代謝產物對產品的污染、簡化γ-氨基丁酸的分離純化過程、降低生產成本，目前谷氨酸脫羧酶的生產和純化逐漸形成產業，有很好的市場前景。

谷氨酸脫羧酶的生產主要采用微生物發酵法和植物提取法。植物提取法是從大豆、米糠、大米胚芽、玉米胚芽等中提取，由于植物中谷氨酸脫羧酶的含量較低，提取前常需要對其內源性酶進行激活，導致生產成本較高，不利于大規模生產。微生物發酵法是以葡萄糖為原料，通過培養具有高活性谷氨酸脫羧酶的微生物細胞如大腸桿菌、乳酸菌等獲得，其具有原料來源廣泛、發酵周期短、生產成本低、易于實現工業化的特點，是一種經濟有效的生產方法。微生物發酵法制備谷氨酸脫羧酶的過程包括微生物細胞的培養和酶的分離純化，在酶的生產成本構成中，分離純化等下游工序的成本占有相當大的比例，因此，如何采用高效的分離技術是谷氨酸脫羧酶生產中需要解決的技術問題。

目前，谷氨酸脫羧酶的分離純化方法主要采用鹽析法、離子交換法、凝膠色譜法等，如許建軍（無錫輕工大學學報，2004.3）在進行谷氨酸脫羧酶酶學性質研究時，采用硫酸銨分級、DEAE-Sepharose?CL-6B層析、Sephacryl?S-200凝膠過濾等手段從乳酸菌細胞中分離純化得到了收率為3.8%的純谷氨酸脫羧酶。侯遠策（黑龍江大學碩士論文，2011）在進行乳酸片球菌產谷氨酸脫羧酶的研究時，采用硫酸銨鹽析、Sepharose?Fast?Flow離子交換層析、Sephadex?G-100葡聚糖凝膠層析對GAD進行了分離純化，得到了收率為15.1％的純谷氨酸脫羧酶。中國專利文獻CN102367432A（申請號201110289796.3）采用鎳柱親和層析純化方法獲得谷氨酸脫羧酶。上述方法存在工藝復雜、生產周期較長、酶活力回收率低、不能連續生產等問題，從而導致了谷氨酸脫羧酶的生產成本較高。因此，改進現有生產技術以及開發新的生產技術以降低谷氨酸脫羧酶的生產成本勢在必行。

反膠團萃取技術是一種新型的生物分離技術，是分離純化生物活性物質的有效方法。反膠團是表面活性劑在非極性有機溶劑中親水性基團自發地向內聚集而成的、內含微小水滴的、空間尺度僅為納米級的集合型膠體，反膠團的微小界面和微小水相具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能和在疏水性環境中使親水性大分子保持活性的功能。反膠團在生物分離過程中具有以下突出的優點：有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性；分離和濃縮可同時進行，過程簡便；能解決生物活性物質在非細胞環境中迅速失活的問題；易于放大和實現工業化生產；溶劑可反復使用，萃取成本低等。

在生化分離工程中形成反膠團體系常用的表面活性劑有陰離子型表面活性劑如琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸納（AOT）、陽離子型表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）以及非離子型表面活性劑如失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span80），常用的非極性有機溶劑有環己烷、庚烷、辛烷、異辛烷等，常用的助溶劑有丁醇、戊醇、己醇等。CTAB是一種陽離子型表面活性劑，形成的反膠團體系適用于相對分子量較大的蛋白質的分離，而Span80是一種非離子型表面活性劑，當其與陽離子型表面活性劑混合在一起形成反膠團時，能增大反膠團的尺寸，使大分子蛋白質的溶解度增加，并且CTAB和Span80構成的反膠團體系對蛋白質還具有更高的分離效率；當在有機溶劑中加入己醇等助溶劑時，也可增大反膠團的尺寸，使大分子蛋白質的溶解度增加。CTAB與異辛烷等形成的反膠團體系在生化分離工程中應用較多，它們形成的反膠團體系結構簡單而穩定，體積相對較大，適用于蛋白質、酶等大分子的分離。采用反膠團萃取技術可實現酶分子的分離純化，其生產成本較低，并能實現連續生產，具有很好的工業應用前景。