[發明專利]胚胎組織塊與胚胎共移植提高牛移植妊娠率的方法

無效

• 申請號: 201019114030.4
• 申請日: 2010-02-04
• 公開（公告）號: CN101773417A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 余文莉;李樹靜
• 申請（專利權）人: 余文莉;李樹靜
• 主分類號: A61D19/04
• 分類號: A61D19/04
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明涉及家畜繁殖學領域，屬胚胎生物技術的范疇，作為提高牛繁殖力的輔助技術。

背景技術

通過添加細胞因子，如牛滋養層蛋白質-1(bTP-1)(Thatcher?et?al.，1989；Bazer?etal.，1991)，干擾素-a(IFN-a)(Plante?et?al.，1988；Plante?et?al.，1989)，干擾素-τ(IFN-τ)，重組蛋白(Mayer?et?al.，1995；Martal?et?al.，1997)，增強妊娠識別信號，有效地延長周期黃體壽命，提高胚胎移植后的受胎率。由于這些蛋白的分離純化和檢測過程復雜，因此在胚胎移植技術中并未廣泛應用。

楊亞衛等(2002)試驗結果，波爾山羊單胚移植的妊娠率為54.1％(53/98)、雙胚為57.7％(77/49)、三胚為66.70％，差異不顯著(P＞0.05)。陳軍等(2007)報道移植三胚、雙胚與移植單胚的受體羊妊娠率分別為71.43％、64.52％和52.50％，差異不顯著。

有研究結果表明，受體牛妊娠率隨半胚移植數目的增加而上升，移植雙半胚較單一全胚妊娠率高，移植效果好，主要是因兩枚半胚有較多的滋養層細胞，為胚胎存活奠定了基礎。

Heyman等(1987)將2個滋養泡與凍胚共移植49頭受體牛，45d、60d和90d妊娠率分別為73％、61％和57％；對照組53頭受體牛45d、60d和90d妊娠率分別為43％、42％和40％。試驗證明了由于冷凍對胚胎造成的損傷可以通過添加滋養泡來克服，提高妊娠率。2005年，Hashiyada等(2005)將體外受精體內培養的胚胎所獲得的不同直徑的滋養泡與半胚共移植，26-43d，38-73d分別獲得66.7％(16/24)和54.2％(13/24)的妊娠率，對照組兩次妊娠率均為34.5％(10/29)；試驗組產犢率為41.7％(10/24)，對照組為27.6％(8/29)。實驗證明，添加滋養泡與半胚共移植能加強妊娠識別信號，提高胚胎妊娠率。通常，滋養泡(Trophoblastic?Vesicles，TVs)是由供體受精后14d孕體獲得，即去除胚盤的胚泡。直徑為0.4-2.0mm滋養泡與胚胎共移植，都能夠阻止黃體溶解，但試驗證明妊娠率并不受滋養泡直徑大小的影響。實驗證明，添加滋養泡與半胚共移植能加強妊娠識別信號，提高胚胎妊娠率。實驗組和對照組受體牛所產牛犢的初生重無差異，具有正常的形態學特征；實驗組牛犢通過與親本血型鑒定，犢牛遺產同一性并未受到滋養泡的影響。同時試驗還證明了妊娠率并不受滋養泡直徑大小的影響。

我國胚胎移植發展起步較晚，尤其是在產業化方面，與美國和加拿大等發達國家有較大差距。胚胎移植妊娠率是直接影響其產業化效益的主要因素。本發明借鑒國外相關提高牛胚胎移植妊娠率的研究方法和研究思路，旨在探索出一種能夠提高牛胚胎移植妊娠率的有效途徑。

發明內容

本發明的目的是從生產應用出發，通過將C級胚胎及用雄性胚胎(胚胎性別鑒定后的副產品)制作的胚胎塊和胚胎滋養層分別與可用胚胎共移植，達到增強妊娠識別信號的目的，從而提高胚胎移植妊娠率。

胚胎組織塊與胚胎共移植提高牛移植妊娠率的方法，其特征是將胚胎組織塊或滋養層組織塊與可用胚胎共移植到一頭受體母牛子宮中。

所述組織塊來源為：經超數排卵處理后所采集的7-8日齡體內受精牛胚胎，1級和2級用于胚胎冷凍、PCR性別鑒定和胚胎移植，3級胚胎和PCR性別鑒定后的奶牛雄性胚胎可用于制作胚胎組織塊。

所述胚胎組織塊的制作步驟為：用雙面刀片線切割成顯微手術刀；做洗刀平皿清洗消毒，以減少污染，降低由于刀粘性增大對胚胎造成的損害；做分割液滴洗胚胎，將胚胎分割成8份并回收。

所述滋養層組織塊制作步驟為：胚胎體外培養，將發育到囊胚或擴囊期的胚胎洗滌并切取滋養層(即囊胚腔)，將其再分為3-4份并回收。

所述胚胎體外培養的方法為二氧化碳培養箱培養法或恒溫試管架培養法。

所述受體母牛為同期發情或自然發情后7.0-8.0天的黃體合格的母牛。

所述共移植步驟為：選1-2塊胚胎組織塊或滋養層組織塊與將要移植的胚胎放在一起，用4段液法裝入一支細管中段，細管裝入移植槍，將胚胎和組織塊一同移植到受體有黃體一側子宮角的上1/3——1/2處。

本發明將雄性胚胎或3級胚胎切割后與可用胚胎共移植，利用組織塊或滋養層中的滋養泡增強妊娠識別信號，相比較滋養層蛋白或干擾素等細胞因子的分離純化和檢測，本方法操作簡便，應用性強。

附圖說明：