[發(fā)明專利]一種腦膜炎球菌多糖結合物中游離多糖含量的測定方法

無效

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• 申請日: 2010-12-30
• 公開（公告）號: CN102175841A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設計）人: 王婷婷;魏文進;何佳琦
• 申請（專利權）人: 北京民海生物科技有限公司;深圳康泰生物制品股份有限公司
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發(fā)明涉及一種游離多糖的測定方法，具體涉及一種A、C、W135、Y群腦膜炎球菌多糖結合物中游離多糖含量的測定方法。

背景技術

腦膜炎球菌感染是引起兒童細菌性腦膜炎和爆發(fā)性敗血癥的首要致病菌。據(jù)統(tǒng)計，全球每年流行性腦膜炎發(fā)病人數(shù)約為50萬，尤其發(fā)展中國家發(fā)病率較高。世界范圍內，幾乎所有腦膜炎疾病都是由A群、B群、C群、Y群和W135群腦膜炎球菌引起的，而接種安全有效的疫苗是預防和控制腦膜炎的理想措施。

目前在國內外上市的腦膜炎疫苗主要有多糖疫苗和多糖結合疫苗兩大類，其中多糖疫苗的抗原為半抗原，是非T細胞依賴性抗原，其誘導的免疫應答沒有T淋巴細胞參與，不能產(chǎn)生免疫記憶。所以WHO曾建議流腦多糖疫苗一般不用于2歲以下嬰、幼兒的接種。流腦多糖結合疫苗則是將提取的腦膜炎球菌莢膜多糖與蛋白載體結合而成，其抗原為T細胞依賴性抗原，其誘導的免疫應答有T淋巴細胞參與，能刺激機體產(chǎn)生高水平抗體，增強對嬰幼兒的免疫記憶，從而提高免疫效果。

多糖結合疫苗中游離多糖的含量是多糖結合疫苗質量控制的關鍵指標之一，游離多糖含量超過規(guī)定限度會對疫苗臨床效果產(chǎn)生不利的影響。因此游離多糖含量是反映結合疫苗質量優(yōu)劣的重要指標。國外文獻報道中有采用疏水層析、HPLC法進行多糖結合物中游離多糖的測定，但因層析過程中易受到分子大小相近雜質的影響，測定結果誤差較大。

國內朱為等人在《A群腦膜炎球菌多糖-破傷風類毒素結合物中游離多糖測定方法的建立》中介紹了一種利用乙醇沉淀法測定A群腦膜炎球菌多糖-破傷風類毒素結合物游離多糖的方法，但該方法操作比較繁瑣，一個樣品需要多天才能獲得結果，同時對游離多糖含量較低的樣品可能存在一定的誤差；

國內黃鎮(zhèn)等人在中國專利200610048876.9中公開了“一種A、C群腦膜炎球菌多糖結合物中游離多糖的測定方法”，此方法需向樣品中加入冷酚溶液進行震蕩，但冷酚毒性較強，對皮膚、粘膜有強烈的腐蝕作用，長期接觸可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能，吸入苯酚也可導致頭痛、頭暈、乏力、視物模糊、肺水腫等。

此外由于不同多糖結合物性質差異較大，因此多糖結合疫苗中游離多糖的測定一直是一個技術難關，目前尚無利用脫氧膽酸鈉萃取方法測定多糖結合物中游離多糖含量的報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有測定游離多糖含量方法的不足，可以準確測定A、C、W135、Y群腦膜炎球菌多糖結合物中游離多糖的含量，操作方法簡單快捷。

本發(fā)明提供的測定一種腦膜炎球菌多糖結合物中游離多糖的方法，取樣、離心、計算多糖濃度、計算游離多糖含量，其中離心時在腦膜炎球菌多糖結合物和待測的腦膜炎球菌多糖結合物對應的衍生物中加入脫氧膽酸鈉溶液。

本發(fā)明提供的測定一種腦膜炎球菌多糖結合物中游離多糖的方法，適用于A、C、W135、Y群腦膜炎球菌多糖結合物。

本發(fā)明提供的測定A、C、W135、Y群腦膜炎球菌多糖結合物中游離多糖的方法，包括以下步驟：

1)取樣：取待檢腦膜炎球菌多糖結合物1ml作為樣1，取待檢腦膜炎球菌多糖結合物對應的衍生物溶液1ml作為樣3；

2)離心：另取腦膜炎球菌多糖結合物1ml置于1.5ml離心管中，取待檢腦膜炎球菌多糖結合物對應的衍生物溶液1ml置于另一1.5ml離心管中；向每離心管加入100μl?1％的DOC(脫氧膽酸鈉)溶液，冰浴保持30分鐘，后加入0.5M?HCl溶液25μl，充分振蕩，5000～6000rpm離心15～20分鐘，每離心管單獨收集上清液1ml，其中結合物上清液為樣2，衍生物上清液為樣4；

3)計算多糖濃度：A群腦膜炎球菌多糖結合物測定磷含量，通過磷含量計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度；C群、W135群、Y群腦膜炎球菌多糖結合物測定唾液酸含量，通過唾液酸含量計算樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度，樣1、樣2、樣3、樣4的多糖濃度分別為C1、C2、C3、C4。

4)計算游離多糖含量：其中P為回收率，H為游離多糖含量