[發(fā)明專利]一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010623612.8
• 申請(qǐng)日: 2010-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN102172237A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐希麗;林登宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京民海生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02;C12N5/07
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存時(shí)必須的一種溶液，長(zhǎng)期以來(lái)大量國(guó)內(nèi)外生物細(xì)胞學(xué)術(shù)相關(guān)書籍介紹的常規(guī)凍存液配方和我們長(zhǎng)期所使用的凍存液各組分體積百分比均為：細(xì)胞培養(yǎng)液70～80％，牛血清10～30％，二甲基亞砜10％。常規(guī)使用的培養(yǎng)液如MEM、M199、Eagle和DMEM等均已市場(chǎng)商品化。

凍存液的作用是使細(xì)胞均勻地分散在溶液中，給細(xì)胞一個(gè)均勻分布的環(huán)境和空間，同時(shí)供給細(xì)胞生命代謝所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，防止或減少冷凍冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。在長(zhǎng)期的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，廣泛使用上述配方凍存細(xì)胞。

大量的實(shí)際生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和大量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，采用這種凍存液所凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后存活率一般在50～70％，成活率比較低。凍存細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇，培養(yǎng)12小時(shí)后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，存活率一般在60％左右；當(dāng)存活率小于50％時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖緩慢，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞比較細(xì)小，長(zhǎng)勢(shì)比較差，基本上不能存活；當(dāng)細(xì)胞存活率在60％左右時(shí)，細(xì)胞分布比較均勻，活細(xì)胞比較多，形態(tài)比較正常，長(zhǎng)滿單層需要6～8天。

目前采用的細(xì)胞凍存液的凍存過程與復(fù)蘇效果：

常規(guī)細(xì)胞凍存液包括以下體積百分比的各組分：

細(xì)胞培養(yǎng)液??????70％，

小牛血清????????20％，

二甲基亞砜??????10％。

以上各組分混勻即成。

細(xì)胞凍存過程：培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的VERO、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細(xì)胞一瓶，其細(xì)胞密度約6×10⁴/cm²、培養(yǎng)面積為225cm²，0.25％的胰酶消化2分鐘，棄掉胰酶，加入培養(yǎng)液10ml，吹打混勻細(xì)胞懸液，離心1500轉(zhuǎn)/10分鐘，棄上清，加入常規(guī)的凍存液20ml混勻，2ml/管分裝入潔凈的凍存管；將該凍存管置于2～8℃2小時(shí)，-20℃2小時(shí)，-80℃過夜，然后浸入液氮中長(zhǎng)期保存。

細(xì)胞復(fù)蘇過程：從液氮中取出凍存的VERO、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17細(xì)胞一管(2ml/管)，置入37℃水浴溶解，離心1500轉(zhuǎn)/10分鐘，棄掉上清，加入20％小牛血清培養(yǎng)液10ml，置37℃培養(yǎng)；培養(yǎng)12小時(shí)候后觀察，可見有60％左右的細(xì)胞貼壁；未長(zhǎng)成單層細(xì)胞，更換10％的小牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，6～8長(zhǎng)滿單層細(xì)胞后傳代培養(yǎng)。

在生物技術(shù)飛速發(fā)展的今天，人們?cè)谏锛夹g(shù)學(xué)及其相關(guān)科學(xué)的研究中，越來(lái)越多的運(yùn)用組織細(xì)胞培養(yǎng)繁殖技術(shù)，將有研究意義或有應(yīng)用前景的組織細(xì)胞采用低溫度進(jìn)行長(zhǎng)期的保存，一旦有需要，可以隨時(shí)對(duì)所的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)其完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特征，供生命科學(xué)研究使用，細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的效果是直接影響細(xì)胞增殖成功與否的的關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液，包括下述體積百分比的各組分：

細(xì)胞培養(yǎng)液??????????????5～20％，

小牛血清????????????????65～80％，

二甲基亞砜??????????????10％，

3％(w/v)谷氨酰胺溶液????1～3％，

7.5％(w/v)碳酸氫鈉溶液??2～4％。

本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液，優(yōu)選包括下述體積百分比的各組分：

細(xì)胞培養(yǎng)液??????????????10～15％，

小牛血清????????????????70～75％，

二甲基亞砜??????????????10％，

3％(w/v)谷氨酰胺溶液????2％，

7.5％(w/v)碳酸氫鈉溶液??3％。

其中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液可任意選用MEM、M199、Eagle或DMEMD。

本發(fā)明還提供所述細(xì)胞凍存液的制備方法，包括混合所述配方比例的細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、二甲基亞砜、3％(w/v)谷氨酰胺溶液和7.5％(w/v)碳酸氫鈉溶液。

本發(fā)明所提供的細(xì)胞凍存液可應(yīng)用于細(xì)胞凍存，可提高凍存細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后的存活率。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在常規(guī)細(xì)胞凍存液組分基礎(chǔ)上增加了3％(w/v)谷氨酰胺溶液，還增加了7.5％(w/v)碳酸氫鈉溶液，同時(shí)調(diào)整了細(xì)胞培養(yǎng)液和小牛血清的含量。